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小分子p53-MDM2 抑制劑先導(dǎo)化合物芐普地爾的研究

2021-04-08 08:37張萬年繆震元安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司安徽淮北35000海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院上海00433
藥學(xué)實(shí)踐雜志 2021年2期
關(guān)鍵詞:孵育產(chǎn)物課題組

羅 川,李 錦,張萬年,繆震元 (. 安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司,安徽 淮北 35000;. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,上海 00433)

老藥新用是藥物設(shè)計(jì)的重要途徑之一,采用此方法可以獲得藥物研究所需的先導(dǎo)化合物,迄今為止已有許多成功的案例,特別是在新型冠狀病毒肺炎治療藥物研究中采用此策略,獲得了很多有價(jià)值的藥物[1-3]。阿司匹林從發(fā)明至今已有百年的歷史,最初用于解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展,在臨床上發(fā)現(xiàn)阿司匹林的新用途,能夠抑制血小板的聚集,抑制心腦血管疾病的發(fā)生[4-5]。因此,從上市藥物中尋找新的適應(yīng)證或?qū)⑵渥鳛橄葘?dǎo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的老藥新用設(shè)計(jì)方法成為藥物研究的有效手段[6-7]。

1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純;6 種藥物原料藥:芐普地爾、保泰松、阿洛西林、鹽酸氮?斯汀、鹽酸多沙普倫、美芬洛酮(南京多點(diǎn)化工有限公司);還原型輔酶Ⅱ(NADPH,東京化學(xué)工業(yè)有限公司);混合人肝微粒體(美國BD Gentest 公司)。

Biotek Synergy H2 多功能酶標(biāo)儀、MK-2 全自動(dòng)酶標(biāo)儀、戴安公司Ultimate3000 液相色譜系統(tǒng)(包括三元輸液泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和真空脫氣機(jī))和AB 公司4000Q-Trap 型串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離源,以及AB 公司Analyst (version 1.5.1)、LightSight (version 2.2.1)數(shù)據(jù)采集及分析軟件。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 p53-MDM2 蛋白結(jié)合抑制活性測(cè)試[8]

將熒光肽(PMDM-F,Anaspec)用緩沖溶液(100 mmol/L 磷酸鉀、0.02%疊氮化鈉、100 μg/ml牛丙種球蛋白,用蒸餾水定容至500 ml,pH 7.5)稀釋至10 nmol/L,加入到梯度稀釋的MDM2 癌基因蛋白中,30oC 避光孵育30 min。熒光各向異性值用Biotek Synergy H2 多功能酶標(biāo)儀讀取,蛋白結(jié)合常數(shù)根據(jù)熒光各向異性值用Mathematica 9 軟件擬合得到。

將購買的6 個(gè)藥物溶于二甲基亞砜(DMSO),緩沖液稀釋至所需要濃度(最終緩沖液中含有1%DMSO)。然后將20 μl 化合物加入到60 μl 含有10 nmol/L PMDM-F 肽和100 nmol/L MDM2 蛋白的溶液中,30oC 避光孵育1 h。熒光各向異性值用Biotek Synergy H2 多功能酶標(biāo)儀讀取,蛋白結(jié)合常數(shù)根據(jù)熒光各向異性值用Mathematica 9 軟件擬合得到。

2.2 蛋白印跡試驗(yàn)[9]

將人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)培養(yǎng),待細(xì)胞生長至70%~80%時(shí),加藥處理。藥物處理不同時(shí)間后,用0.25%胰酶消化,離心收集細(xì)胞,再用胞漿蛋白核蛋白裂解液4 ℃裂解,提取胞漿蛋白及核蛋白。采用12 %SDS-PAGE 凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移到固相支持膜(PVDF 膜)上,封閉液室溫封閉1~2 h,用等滲緩沖鹽溶液(tris-buffered saline tween-20,TBST)洗膜5 min,洗3 次。采用TBST 稀釋抗體,4 ℃孵育過夜,TBST 洗膜5 min,洗3 次。然后用TBST 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,TBST洗膜5 min,洗3 次。暗室內(nèi)采用ECL 顯色,X 線片曝光成像。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照,分析成像光片灰度值,并以對(duì)照組為基準(zhǔn)進(jìn)行量化。

2.3 體外抗腫瘤活性測(cè)試[10]

樣品配制:用DMSO 溶解后,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)配成1 000 μg/ml 的溶液或均勻的混懸液,然后用含DMSO 的PBS 稀釋。

MTT 比色法:96 孔板每孔加入濃度為(5~6)×104個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液100 μl,置37oC,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h 后,加入樣品液,10 μl/孔,設(shè)雙復(fù)孔,37oC、5% CO2作用72 h。每孔加入5 mg/ml的MTT 溶液20 μl,作用4 h 后加入溶解液,100 μl/孔,置培養(yǎng)箱內(nèi),溶解后用MK-2 全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處A 值,計(jì)算IC 值。

IC(%) =[(空白對(duì)照孔A 值-給藥孔A 值) /空白對(duì)照孔A 值]×100%

根據(jù)不同濃度的IC 值,進(jìn)行線性回歸,計(jì)算出抑制腫瘤細(xì)胞生長50%的藥物濃度,即IC50。

2.4 體外代謝研究[11]

每個(gè)孵育體系總體積為200 μl,介質(zhì)為100 mmol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7.4),包括終濃度為1 mg/ml的肝微粒體蛋白、50 μmol/L 的芐普地爾和2 mmol/L的還原型輔酶Ⅱ(NADPH),用37°C 水浴進(jìn)行孵育,60 min 后加入同體積冰冷乙腈終止反應(yīng)。被終止反應(yīng)的肝微粒體孵化樣品,離心5 min(13 000 r/min),取出全部上清液置于10 ml 試管中,于40oC 空氣流下吹干,殘留物以100 μl 乙腈/水(10: 90, V/V)復(fù)溶,取10 μl 進(jìn)行HPLC/Q-Trap MS 分析。色譜條件為色譜柱為Kromasil? C18(150 mm×2.1 mm,5 μm),Agilent C18保護(hù)柱(12.5 mm ×2.1 mm,5 μm)。流動(dòng)相:乙腈(A)-10 mmol/L 甲酸銨水溶液(B),梯度洗脫:0~2 min,10% A;10~15 min,90% A;15.1~18 min,10% A;流速為0.3 ml/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為10 μl。質(zhì)譜條件為電噴霧離子化源(ESI),正離子檢測(cè)。霧化溫度為500 ℃,電噴霧電壓為5 200 V,氣簾氣流速20 L/min,霧化氣50 L/min,輔助氣流速50 L/min。掃描方式為MRMMIM 簇發(fā)EPI。

3 結(jié)果

3.1 p53-MDM2 蛋白相互作用抑制活性

課題組在針對(duì)p53-MDM2 靶標(biāo)進(jìn)行虛擬篩選過程中,發(fā)現(xiàn)Wayne 等已運(yùn)用計(jì)算機(jī)構(gòu)象篩選法對(duì)ZINC 數(shù)據(jù)庫中3 244 個(gè)FDA 已批準(zhǔn)上市藥物進(jìn)行了篩選,鑒別出與p53-MDM2 抑制劑Nutlin-3a結(jié)構(gòu)不同,但具有類似形狀電荷分布的化合物[12]。然后,通過Autodock 軟件與MDM2 蛋白進(jìn)行分子對(duì)接,根據(jù)結(jié)合能獲得打分函數(shù)排名前15 的化合物,但未用分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其作用靶標(biāo)。因此,課題組購買了可售的6 個(gè)藥物(圖1)。對(duì)這6 個(gè)藥物進(jìn)行蛋白結(jié)合抑制活性實(shí)驗(yàn),以Nutlin-3為陽性對(duì)照藥,結(jié)果見表1。

從表1 中可以看出,6 個(gè)藥物中美芬諾酮、鹽酸氮?斯汀、芐普地爾和保泰松4 個(gè)藥物體現(xiàn)出一定的p53-MDM2 蛋白結(jié)合抑制活性,其余2 個(gè)藥物無活性。其中,鈣離子拮抗劑芐普地爾的Ki值達(dá)到0.456 μmol/L,顯示出優(yōu)異的p53-MDM2 蛋白結(jié)合抑制活性。

圖1 6 個(gè)市售藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 蛋白結(jié)合抑制活性和體外抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果

為驗(yàn)證芐普地爾是否能抑制p53-MDM2 蛋白結(jié)合,采用免疫印跡試驗(yàn)測(cè)定相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,結(jié)果如圖2。從圖中可以看出,芐普地爾對(duì)p53 蛋白表達(dá)作用相對(duì)較小,并且隨著芐普地爾濃度上升到10 μmol/L,反而出現(xiàn)下降。但芐普地爾能顯著降低MDM2 蛋白的表達(dá),而且呈劑量依賴關(guān)系,初步說明芐普地爾能明顯抑制p53-MDM2蛋白結(jié)合。

3.2 體外抗腫瘤活性研究

課題組選擇骨肉瘤(U-2OS、Saos-2)和肺癌(A549、NCI-H1299) 2 組細(xì)胞株進(jìn)行了6 個(gè)藥物的體外抗腫瘤活性測(cè)試(表1)。從表1 中可以看出,芐普地爾對(duì)4 種細(xì)胞株均具有優(yōu)秀的抗腫瘤活性,其IC50值均低于3 μmol/L,優(yōu)于陽性對(duì)照藥Nutlin-3。而美芬諾酮盡管具有中等的p53-MDM2 蛋白結(jié)合抑制活性(Ki=5.79 μmol/L),但除對(duì)A549 具有較好的抗腫瘤活性,其余細(xì)胞株均未顯示出活性。令人意外的是鹽酸氮?斯汀盡管具有較弱的p53-MDM2蛋白結(jié)合抑制活性,但對(duì)4 種腫瘤細(xì)胞株也顯示出較好的活性。

3.3 芐普地爾的體外代謝研究

圖2 芐普地爾對(duì)A549 細(xì)胞中MDM2 及p53 蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(μmol/L)

表2 芐普地爾在肝微粒體孵化體系中的代謝產(chǎn)物信息

圖3 芐普地爾在肝微粒體孵化體系中代謝產(chǎn)物的色譜圖

課題組進(jìn)一步對(duì)芐普地爾開展了人肝微粒體中代謝產(chǎn)物研究,結(jié)果見表2、圖3 和圖4。發(fā)現(xiàn)在經(jīng)人肝微粒孵化后的樣品中除原形藥物(M0,m/z 367)外,在保留時(shí)間為9.8 min 處檢測(cè)到1 個(gè)色譜峰,命名為M1,其m/z 為383。推測(cè)其分子式組成為C24H34N2O2,比原形增加1 個(gè)O,可能為單氧化代謝產(chǎn)物。在MS/MS 掃描質(zhì)譜圖中,由M1 獲得的主要碎片離子為m/z 312、212、184(圖4),其中m/z 312、212 比原形的主要碎片離子m/z 296、196,相對(duì)分子質(zhì)量增加16,而碎片184 與原形的相同,且未見相對(duì)分子質(zhì)量少18 的碎片,推測(cè)其為苯環(huán)羥基化代謝產(chǎn)物。

4 結(jié)論

基于老藥新用的藥物設(shè)計(jì)思想,課題組驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)鈣離子拮抗劑芐普地爾具有優(yōu)秀的抗腫瘤活性和較強(qiáng)的p53-MDM2 蛋白結(jié)合抑制活性。進(jìn)一步通過免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),芐普地爾能顯著降低MDM2 蛋白的表達(dá),而且呈劑量依賴。體外代謝研究發(fā)現(xiàn),芐普地爾在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物主要是苯環(huán)羥基化單氧化代謝產(chǎn)物。研究結(jié)果表明,芐普地爾可作為p53-MDM2 蛋白結(jié)合小分子抑制劑先導(dǎo)化合物,用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計(jì)研究。

圖4 代謝產(chǎn)物M1 的MS/MS 質(zhì)譜圖

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