李維香 張繼光 吳萬富 呂世懂

(昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，昆明 650118)

脂肪酸值是衡量糧食游離脂肪酸含量的指標(biāo)，游離脂肪酸是糧食及其加工制品中脂肪氧化分解產(chǎn)生的。糧食脂肪酸值測定在糧食質(zhì)量檢驗(yàn)工作中占有非常重要的地位，是稻谷、玉米儲(chǔ)存品質(zhì)檢驗(yàn)的關(guān)鍵性指標(biāo)，在保障儲(chǔ)備糧質(zhì)量安全工作中占有舉足輕重的地位；是衡量小麥粉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，它反映了小麥粉的新鮮程度。隨著糧食儲(chǔ)藏時(shí)間、儲(chǔ)藏環(huán)境溫度、濕度、加工方式的變化，糧食及其加工制品中游離脂肪酸的含量都會(huì)發(fā)生變化，根據(jù)脂肪酸值的變化可以判斷儲(chǔ)存糧食的陳化程度、小麥粉等糧食加工制品的品質(zhì)變化情況，因此脂肪酸值是衡量糧食劣變過程的主要指標(biāo)。由于脂肪酸值測定影響因素較多，干擾了脂肪酸值測定的準(zhǔn)確性、可靠性。這些因素主要包括樣品的粉碎方式、粉碎細(xì)度、粉碎樣品的放置時(shí)間、環(huán)境溫度、樣品提取時(shí)間、濾液靜置時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)溶液、測定用水、終點(diǎn)判定等，這些影響因素前人已進(jìn)行過很多研究，龐文祿[1]研究了樣品粉碎方式、粉碎細(xì)度、環(huán)境溫度、樣品提取時(shí)間、濾液靜置時(shí)間等對脂肪酸值測定結(jié)果的影響；楊軍等[2]探討了樣品粉碎細(xì)度、粉碎磨升溫、標(biāo)液濃度、樣品提取時(shí)間、濾液靜置時(shí)間等對脂肪酸值測定結(jié)果的影響；王茜茜等[3]研究了粉碎后的樣品放置時(shí)間對脂肪酸值測定結(jié)果的影響。為消除這些影響，脂肪酸值測定方法標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20569—2006《稻谷儲(chǔ)存品質(zhì)判定規(guī)則》[4]、GB/T 20570—2015《玉米儲(chǔ)存品質(zhì)判定規(guī)則》[5]、GB/T 5510—2011《糧油檢驗(yàn) 糧食、油料脂肪酸值測定》[6]、GB/T 29405—2012《糧油檢驗(yàn) 谷物及制品脂肪酸值測定 儀器法》[7]、GB/T 15684—2015 《谷物碾磨制品 脂肪酸值的測定》[8]對測定條件都作了明確的規(guī)定。通過對振蕩器振幅、指示劑、測定用水、標(biāo)準(zhǔn)溶液對糧食脂肪酸值測定的影響進(jìn)行深入分析，本研究對現(xiàn)行糧食脂肪酸值測定方法進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器

916 Ti-Touch自動(dòng)電位滴定儀，水相酸堿滴定專用復(fù)合pH電極，10 mL堿式滴定管：最小分度值0.05 mL；振幅30 mm的往復(fù)式振蕩器，振幅20 mm的往復(fù)式振蕩器，3100錘式旋風(fēng)磨。

1.2 試劑

無水乙醇(AR)、95%乙醇(AR)、酚酞(AR)、百里香酚藍(lán)(AR)、N,N-二甲基甲酰胺(AR)、百里香酚藍(lán)指示劑：1.0%，稱取1.0 g百里香酚藍(lán),用少量N,N-二甲基甲酰胺溶解，再用95%乙醇定容到100 mL，密閉放置24 h備用；酚酞指示劑：1.0%，稱取1.0 g酚酞溶于100 mL 95%乙醇中；0.01 mol/L的95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：參照GB/T 20569—2006配制；0.01 mol/L的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：參照GB/T 601—2016[9]配制。

1.3 樣品

稻谷和玉米樣品來自糧食儲(chǔ)備庫；小麥粉樣品來自市售商品小麥粉；紅米稻、紅玉米等“有色”糧食來自糧食收儲(chǔ)企業(yè)。

1.4 脂肪酸值測定方法

手工滴定法：參照GB/T 20569—2006執(zhí)行。振蕩提取時(shí)間：稻谷10 min，玉米30 min，小麥粉40 min。用百里香酚藍(lán)作為指示劑時(shí)，加3滴百里香酚藍(lán)指示劑于提取液中，待測液變?yōu)辄S色，當(dāng)?shù)味ㄒ簭狞S色變?yōu)槲⑺{(lán)色30 s不消失即為滴定終點(diǎn)。

電位滴定法：GB/T 29405—2012第二法。振蕩提取時(shí)間：稻谷10 min，玉米30 min，小麥粉40 min。儀器參數(shù)設(shè)置：采用預(yù)設(shè)終點(diǎn)pH滴定模式(SET-pH)測定脂肪酸值，滴定過程以酚酞指示劑進(jìn)行監(jiān)測。自動(dòng)電位滴定儀參數(shù)設(shè)置為終點(diǎn)pH：9.25～9.35；平衡時(shí)間：10 s；最大滴定速度：10 mL/min；最小滴定速度：10 μL/min；動(dòng)態(tài)范圍：4.0；停止判據(jù)：漂移；停止漂移：20 μL/min；攪拌速度：8。自動(dòng)電位滴定儀參數(shù)設(shè)置方法為用酚酞指示劑監(jiān)測終點(diǎn)，以微紅30 s不消失為空白滴定終點(diǎn)，以明顯有色差為樣液滴定終點(diǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

參照LS/T 6402—2017[10]執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 振蕩器的振幅對脂肪酸值測定的影響

GB/T 20569—2006、GB/T 20570—2015、GB/T 5510—2011、GB/T 29405—2012規(guī)定脂肪酸提取采用的振蕩器為往復(fù)式，振蕩頻率為100 次/min，未明確振蕩器的振幅。

采用電位滴定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了考察不同振幅的振蕩器對測定結(jié)果的影響，選擇稻谷、玉米、小麥粉樣品各8份，分別用振幅為30、20 mm，振蕩頻率為100次/min的不同振蕩器提取脂肪酸，比較脂肪酸值測定結(jié)果。采用配對t檢驗(yàn)，考察用不同振幅的振蕩器提取的樣品溶液，測定結(jié)果是否存在顯著性差異。比較結(jié)果見表1。

表1 振蕩器振幅對糧食脂肪酸值測定結(jié)果影響比較

由表1可知，在95%置信概率下，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td=8.753，遠(yuǎn)高于查表值t0.05,23=2.068 7，表明30 mm振幅與20 mm振幅的振蕩器提取法之間存在顯著性差異。30 mm振幅振蕩器提取法顯著高于20 mm振幅振蕩器提取法的測定數(shù)據(jù)，24份樣品平均為0.72 mgKOH/100 g。表明脂肪酸的提取率與振蕩器的振蕩強(qiáng)度有關(guān)，振幅越大，振蕩強(qiáng)度就越大，提取率也越高。因此，在測定方法中，應(yīng)明確所選用振蕩器的振幅。往復(fù)式振蕩器的振蕩頻率為100 次/min，稻谷提取時(shí)間為10 min、玉米為30 min、小麥粉為40 min時(shí)，宜選用振幅為20 mm的振蕩器。

2.2 百里香酚藍(lán)指示劑與酚酞指示劑測定結(jié)果比較

GB/T 20569—2006、GB/T 20570—2015中，手工滴定法以酚酞指示劑測定脂肪酸值，一是待測液中的酸為有機(jī)弱酸，用強(qiáng)堿滴定弱酸突變不顯著；二是糧食本身色素的影響，以“微紅”判定終點(diǎn)，往往滴定過量。在實(shí)際操作中，通常以“色差”來判定終點(diǎn)，但因樣品基質(zhì)的干擾，樣液往往混濁而掩蓋了這種變化；不同操作者對顏色的敏感度存在差異，對色差變化的觀察不一致，造成不同操作者對同一樣品的測定誤差較大，影響了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為改進(jìn)脂肪酸滴定的終點(diǎn)判定，不少學(xué)者從多方向開展了研究。蓋澤廣[11]提出用百里香酚藍(lán)指示劑代替酚酞指示劑測定糧食脂肪酸值，并進(jìn)行了初步研究。糧食中的脂肪酸是有機(jī)弱酸，用強(qiáng)堿滴定，突躍范圍pH值8.0～9.7。酞酚的變色范圍pH值8.0～10.0，由無色變?yōu)闇\紅色。百里香酚藍(lán)有兩個(gè)變色范圍，一個(gè)變色范圍pH值1.2～2.8，由紅色變?yōu)辄S色，糧食脂肪酸提取溶液的pH值一般都超過3，所以加入百里香酚藍(lán)指示劑，溶液即變?yōu)辄S色；另一個(gè)變色范圍pH值8.6～9.6，由黃色變?yōu)樗{(lán)色。兩種指示劑的變色范圍都恰好在滴定脂肪酸的突躍范圍內(nèi)，因此，用百里香酚藍(lán)代替酞酚指示劑滴定脂肪酸是可行的。

在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇百里香酚藍(lán)代替酚酞指示劑開展進(jìn)一步研究，以改進(jìn)終點(diǎn)判定的穩(wěn)定性。酚酞指示劑法采用電位滴定，以微紅或明顯色差30 s不消失為滴定終點(diǎn)；百里香酚藍(lán)指示劑法采用手工滴定，以微藍(lán)30 s不消失為滴定終點(diǎn)。選擇稻谷、玉米、小麥粉樣品各8份，分別用兩種滴定方法測定脂肪酸值。采用配對t檢驗(yàn)，考察不同指示劑滴定的結(jié)果是否存在顯著性差異。比較結(jié)果見表2。

表2 百里香酚藍(lán)指示劑滴定法與酚酞指示劑滴定法測定糧食脂肪酸值結(jié)果比較

由表2可知，在95%置信概率下，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td=1.566，遠(yuǎn)小于查表值t0.05,23=2.068 7，表明百里香酚藍(lán)指示劑滴定法與酚酞指示劑滴定法測定糧食脂肪酸值之間不存在顯著性差異，可以用百里香酚藍(lán)指示劑代替酚酞指示劑測定糧食脂肪酸值。

選擇 “有色”糧食樣品8份，分別用電位滴定法和百里香酚藍(lán)指示劑手工滴定法測定脂肪酸值，采用配對t檢驗(yàn)考察兩種方法的測定結(jié)果的顯著性差異。比較結(jié)果見表3。

表3 百里香酚藍(lán)指示劑手工滴定法與電位滴定法測定“有色”糧食脂肪酸值結(jié)果比較

由表3可知，在95%置信概率下，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td=0.401，遠(yuǎn)小于查表值t0.05,7=2.364 6，表明百里香酚藍(lán)指示劑滴定法與國標(biāo)電位滴定法之間不存在顯著性差異，即百里香酚藍(lán)指示劑手工滴定法還可以測定“有色”糧食的脂肪酸值。

用百里香酚藍(lán)指示劑測定脂肪酸，顏色從黃色變?yōu)槲⑺{(lán)色，其變化過程為先褪色后變色，顏色變化比較明顯，易于觀察，解決了酚酞指示劑終點(diǎn)判定難導(dǎo)致測定結(jié)果不穩(wěn)定的問題；百里香酚藍(lán)指示劑獨(dú)特的變色過程，還適用于測定黑米稻、紫米稻、紅米稻、紅玉米、黑玉米等“有色”糧食的脂肪酸值，測定方法的應(yīng)用范圍更為廣泛。

2.3 不同實(shí)驗(yàn)用水測定結(jié)果比較

為了消除測定過程CO2對測定結(jié)果的影響，GB/T 20569、GB/T 20570規(guī)定脂肪酸值測定用水為現(xiàn)制不含CO2的蒸餾水，操作繁瑣，用時(shí)長，影響測定效率。研究發(fā)現(xiàn)，測定過程要扣除空白，可以消除CO2的影響。

比較用現(xiàn)制不含CO2的蒸餾水、10 d前制備的密閉存放的不含CO2的蒸餾水、三級(jí)水測定結(jié)果，以判斷不同水質(zhì)對測定脂肪酸值的影響，結(jié)果見表4、表5。

表4 密閉存放的不含CO2蒸餾水與現(xiàn)制不含CO2的蒸餾水測定糧食脂肪酸值結(jié)果比較

表5 三級(jí)水與現(xiàn)制不含CO2的蒸餾水測定糧食脂肪酸值結(jié)果比較

由表4、表5可知，在95%置信概率下，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td分別為0.258、1.918，都遠(yuǎn)小于查表值t0.05,8=2.306 0。表明用10 d前制備的密閉存放的不含CO2的蒸餾水、三級(jí)水與現(xiàn)制不含CO2的蒸餾水測定糧食脂肪酸值之間不存在顯著性差異，可以用密閉存放的不含CO2的蒸餾水或三級(jí)水代替現(xiàn)制不含CO2的蒸餾水測定糧食脂肪酸值。

2.4 水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液與95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定結(jié)果比較

GB/T 20569、GB/T 20570、GB/T 5510、GB/T 15684、GB/T 29405等都規(guī)定以95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定脂肪酸值。乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液穩(wěn)定性差，容易變性，使標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度快速下降?，F(xiàn)配滴定溶液繁瑣，且測定過程稍長，就容易導(dǎo)致測定值偏高。嘗試用0.01 mol/L的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液取代0.01 mol/L的95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定脂肪酸值。

2.4.1 水溶劑與95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定結(jié)果比較

選擇稻谷、玉米、小麥粉樣品各4份，分別用水溶劑和95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定脂肪酸值，測定結(jié)果及分析見表6。

表6 水溶劑與95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值結(jié)果比較

由表6可知，在95%置信概率下，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td=0.481，遠(yuǎn)小于查表值t0.05,11=2.201 0，表明用0.01 mol/L的水溶劑與95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定脂肪酸值之間不存在顯著性差異。可以用水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液取代95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值。

2.4.2 水溶劑與95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液穩(wěn)定性比較

2.4.2.1 長期穩(wěn)定性比較

用1個(gè)月前配制并在室溫25 ℃以下密閉放置的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液與現(xiàn)配制的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值，比較測定結(jié)果的差異，考察標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的長期穩(wěn)定性，見表7、表8。

表7 1個(gè)月前配制與現(xiàn)配制的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值結(jié)果比較

表8 1個(gè)月前配制與現(xiàn)配制的95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值結(jié)果比較

在95%置信概率下，1個(gè)月前配制并密閉放置的與現(xiàn)配制的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定結(jié)果比較，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td為1.786，小于查表值t0.05,7=2.364 6，表明用1個(gè)月前配制并在室溫下密閉放置的與用現(xiàn)配制的水溶劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值之間不存在顯著性差異，即密閉放置1個(gè)月的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度未發(fā)生顯著性變化。

由表8可知，在95%置信概率下，1個(gè)月前配制并密閉放置的與現(xiàn)配制的95%乙醇溶劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定結(jié)果比較，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td=3.808，遠(yuǎn)大于查表值t0.05,7=2.364 6，表明用1個(gè)月前配制并在室溫下密閉放置的與用現(xiàn)配制的95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值之間存在顯著性差異，測定值平均為2.69 mgKOH/100 g，即密閉放置1個(gè)月的95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度已顯著降低。

2.4.2.2 短期穩(wěn)定性比較

分別用在室溫下(20±5) ℃半敞口放置的水溶劑和95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液每隔1 h對同一樣品提取液測定一次脂肪酸值作為實(shí)驗(yàn)組，并用密閉放置的現(xiàn)配標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液每隔1 h對同一樣液測定一次脂肪酸值作為對照組，連續(xù)測定5 h，用實(shí)驗(yàn)組測定值與對照組測定值之差考察兩種溶劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的短期穩(wěn)定性。見表9和圖1。

表9 半敞口放置的水溶劑和95%乙醇溶劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液不同放置時(shí)間測定結(jié)果與對照組比較變化情況

圖1 半敞口放置的水溶劑和95%乙醇溶劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液不同放置時(shí)間測定結(jié)果與對照組比較變化關(guān)系圖

表9和圖1顯示，隨著放置時(shí)間的增加，試驗(yàn)組的測定值也增加，表明標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度逐漸下降。半敞口放置的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定值隨放置時(shí)間的上升要比95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的測定值隨放置時(shí)間的上升要慢得多，即在室溫下(20±5) ℃半敞口放置的水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液比同樣條件下放置的95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度下降緩慢。

結(jié)果表明，水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性比95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液高，更適宜用作糧食脂肪酸值測定的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。

2.5 脂肪酸值測定方法的優(yōu)化

分別用百里香酚藍(lán)指示劑、三級(jí)水、水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液代替現(xiàn)行國標(biāo)方法中的酚酞指示劑、現(xiàn)制不含CO2蒸餾水、95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定稻谷、玉米、小麥粉的脂肪酸值進(jìn)行比較，結(jié)果及分析見表10。

表10 優(yōu)化后與優(yōu)化前的脂肪酸值測定方法測定結(jié)果比較

在95%置信概率下，配對t檢驗(yàn)的計(jì)算值td=0.105，遠(yuǎn)小于查表值t0.05,8=2.306 0，表明優(yōu)化后與優(yōu)化前的測定方法之間不存在顯著性差異。但優(yōu)化后的測定方法操作更為簡便、終點(diǎn)更易識(shí)別、測定更為穩(wěn)定、適用范圍更廣、測定效率更高。

3 結(jié)論

不同振幅的振蕩器對糧食脂肪酸值的提取率造成顯著影響。在測定糧食脂肪酸值時(shí)應(yīng)當(dāng)關(guān)注所使用振蕩器的振幅，并在測定方法中明確振蕩器的振幅。

用百里香酚藍(lán)和用酚酞作為指示劑測定糧食脂肪酸值結(jié)果不存在顯著差異。但用百里香酚藍(lán)作為指示劑終點(diǎn)更易觀察，適用范圍更廣。

用水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液和95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液測定糧食脂肪酸值結(jié)果不存在顯著差異。但水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的長期、短期穩(wěn)定性更高，使用水溶劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液可以簡化配制程序，測定更為簡便，并能提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在現(xiàn)行國標(biāo)中，用三級(jí)水代替現(xiàn)制不含 CO2蒸餾水、用百里香酚藍(lán)指示劑代替酚酞指示劑、用水溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液代替95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，可以使方法得到極大優(yōu)化。一是簡化了操作過程，有利于提高測定效率；二是解決目前國標(biāo)手工滴定法“終點(diǎn)判定難”的問題，使終點(diǎn)判定變得容易，同時(shí)提高了方法的適用范圍，使手工滴定法不僅適用于普通糧食，還適用于“有色”糧食的脂肪酸值測定；三是解決了95%乙醇溶劑氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液不穩(wěn)定的問題，間接提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。經(jīng)優(yōu)化后的方法具有較高的推廣價(jià)值。