韓 蜜，陳 鎮(zhèn)，朱鎮(zhèn)華，龍運(yùn)雄，歐陽林旗，伍夢玲，鄧桂明

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；2.湖南省腫瘤醫(yī)院，長沙 410013）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是指發(fā)生在鼻咽腔頂部及側(cè)壁部位的惡性腫瘤，是中國南方地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，具有家族遺傳傾向，與EB病毒的感染有關(guān)。其發(fā)病率位居頭頸部惡性腫瘤之首。目前，臨床治療鼻咽癌的方法主要包括放療、化療、同步放化療等。因鼻咽部位處于頭顱中央，與周圍重要的組織和器官關(guān)系非常密切，因而鼻咽癌常出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以完全切除病灶，而鼻咽癌對放射線高度敏感，因此放療成為臨床治療鼻咽癌最主要的手段。但放療在有效治療鼻咽癌的同時也會引起放射性皮膚損傷、唾液腺損傷、放射性耳鼻損傷等一系列局部不良反應(yīng)，還會引起白細(xì)胞數(shù)量減少、頭痛頭暈、貧血、腹痛腹脹等全身不良反應(yīng)［1］。因此，尋找價廉、安全、副作用小的治療藥物是臨床所需。與化學(xué)藥物相比，中藥復(fù)方在控制預(yù)防復(fù)發(fā)、減毒增效、腫瘤增殖、改善生活質(zhì)量、延長生存期等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢［2］。

鼻咽解毒膠囊為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自研制劑，由黃連、黃芩、黃芪、白花蛇毒草和甘草五味藥制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、扶正培本之功效，主要用于鼻炎、鼻咽癌和EB病毒陽性的鼻咽癌高危人群抗病毒治療?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃連具有較強(qiáng)的抗菌作用，而且抗菌譜較廣，在抗腫瘤方面具有良好的前景；黃芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗氧化及良好的改善心血管功能的作用，抗腫瘤的作用日益受到人們的重視；黃芪中的黃芪多糖具有抗腫瘤、促進(jìn)抗體合成、促進(jìn)免疫、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力等多種作用［3，4］；白花蛇舌草含黃酮類化合物、環(huán)烯醚萜類化合物、蒽醌類化合物等，可抑制腫瘤細(xì)胞增長并誘導(dǎo)其凋亡和清熱解毒、化瘀利尿等功效［5，6］；甘草具有抗腫瘤、抗病毒、抑制脂質(zhì)過氧化和抗自由基氧化等多種生物學(xué)活性［7］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)，從整體上分析中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制；分子對接法是研究藥物中化合物和蛋白受體之間的作用，并能預(yù)測配體-受體親和力的一種方法。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，從分子層面探討鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌的具體機(jī)制，為鼻咽解毒膠囊臨床應(yīng)用提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)，為新藥的開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、GeneCards（https：//www.genecards.org/），OMIM（https：//www.omim.org/）、Venny 2.1、String（https：//stringdb.org/cgi/input.pl）、Cystoscap 3.6.0、Cytoscape3.7.2、NetworkAnalyzer、R3.6.3等。

1.2 鼻咽解毒膠囊活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以單味藥黃連、黃芩、黃芪、白花蛇舌草和甘草的標(biāo)準(zhǔn)中文名稱或拉丁文為檢索詞，以口服生物利用度（OB）≥30% 及類藥性（DL）≥0.18為篩選條件獲取中藥活性成分和靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)收集與Venny圖的繪制以鼻咽癌的英文名“nasopharyngeal carcinoma”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https：// www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫和 OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）進(jìn)行靶點(diǎn)檢索，將兩個數(shù)據(jù)庫檢索到的基因合并刪重。將篩選出的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，獲得鼻咽解毒膠囊的靶點(diǎn)與鼻咽癌靶點(diǎn)的交集圖，從而得到鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了更好的理解中藥、成分與其相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，應(yīng)用Cytoscape3.7.2軟件，以納入的復(fù)方中藥、對應(yīng)的中藥成分、治療疾病以及作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鰧⑺幬锛膊」灿邪悬c(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.6.0中，通過NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以degree，betweenness centrality，average shortest path length 和 closeness centrality這四個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過degree排序。

1.6 GO 和 KEGG 分析將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，選擇生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cell component，CC）三個模塊，引用String 數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進(jìn)行篩選。使用R 3.6.3 進(jìn)行柱狀圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽解毒膠囊有效化合物及化合物作用靶點(diǎn)的收集通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜集5種中藥的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)，根據(jù)“OB≥30%、DL≥0.18”篩選后，黃連獲得14個成分，167個靶點(diǎn)；黃芪獲得20個成分，191個靶點(diǎn)；黃芩獲得36個成分，106個靶點(diǎn)；白花蛇舌草獲得7個成分，172個靶點(diǎn)；甘草獲得93個成分，213個靶點(diǎn)，去掉重復(fù)的成分后得到156個化學(xué)成分，242個作用靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫以“nasopharyngeal carcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行疾病靶點(diǎn)檢索，在Genecards數(shù)據(jù)庫檢索到1797個基因，在OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到188個基因，將兩個數(shù)據(jù)庫檢索到的基因合并刪重后，總共得到1961個基因。通過 Venny2.1.0軟件獲取鼻咽解毒膠囊和鼻咽癌的作用靶點(diǎn)交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)交集靶點(diǎn)128個，約占交集總數(shù)的 6.2%，得到鼻咽解毒膠囊和鼻咽癌的 Venny 圖，見圖1。

2.2 構(gòu)建中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)將鼻咽解毒膠囊活性成分與鼻咽癌-鼻咽解毒膠囊交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建了中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中黃色為藥物作用于疾病的靶點(diǎn)，藍(lán)色為中藥的有效活性成分，紫色為中藥，紅色為疾病即鼻咽癌。每條邊表示疾病-藥物所對應(yīng)靶點(diǎn)、藥物所對應(yīng)化學(xué)成分以及藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中槲皮素（quercetin）、漢黃芩素（wogonin）、山奈酚（kaempferol）、黃芩素（baicalein）等15種活性所對應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)目較多，說明它們可能是鼻咽解毒膠囊的關(guān)鍵活性成分，結(jié)果見表1。

表1 鼻咽解毒膠囊15種活性成分信息及對應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將藥物疾病共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.6.0 中，PPI 網(wǎng)絡(luò)（富集 P 值＜ 1.0e×10-16）包含 128 個節(jié)點(diǎn)，2693條邊，節(jié)點(diǎn)的平均度值（degree）為 42.1。節(jié)點(diǎn)（node）表示蛋白，邊（edge）表示蛋白之間的相互作用關(guān)系。依據(jù)節(jié)點(diǎn)度值大小，AKT1（105）、IL6（95）、CASP3（94）、VEGFA（94）這 4 個靶點(diǎn)蛋白可能在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn) Venny 圖

圖2 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 鼻咽解毒膠囊-鼻咽癌交集靶點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 與 KEGG 富集分析將 128 個鼻咽解毒膠囊 -鼻咽癌交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行 GO 和 KEGG富集分析（限定物種：Homo sapiens；P＜0.05）。結(jié)果，共得到 GO 富集條目2357個，其中生物過程（biological process，BP）2188項，主要涉及腺體發(fā)育、類固醇激素反應(yīng)、細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)等；分子功能（molecular function，MF）相關(guān)118項，主要涉及整聯(lián)蛋白結(jié)合、MAP激酶活性、蛋白酶結(jié)合等；細(xì)胞組成（cell component，CC）相關(guān)51項，主要涉及核染色、蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等。共得到 83 個 KEGG 富集條目，主要涉及多物種細(xì)胞凋亡通路、催乳素信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥機(jī)制。依據(jù) P 值篩選排名前 10的 GO 富集分析和排名前 20 的 KEGG 富集分析，使用R 3.6.3 進(jìn)行柱狀圖繪制（圖4、圖5）。

圖4 鼻炎解毒膠囊-鼻咽癌交集靶點(diǎn) GO 富集分析柱狀圖

圖5 鼻咽解毒膠囊-鼻咽癌交集靶點(diǎn) KEGG 富集分析柱狀圖

2.5 鼻咽解毒膠囊主要活性成分與對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的分子對接驗(yàn)證利用AutoDock Vina 1.1.2對四個受體蛋白AKT1（PDBID ：4EKL）、CASP3（PDBID ：2J32）、IL6（PDBID ：1ALU）、VEGFA（PDBID：1VPF）與15個配體小分子槲皮素、漢黃芩素、山奈酚、黃芩素等分別進(jìn)行分子對接，結(jié)合能打分及對接參數(shù)如表2所示，AutoDock Vina將結(jié)果以一種親和能（Affinity）的形式輸出，通過計算受體-配體復(fù)合物的空間效果、排斥作用、氫鍵、疏水相互作用以及分子的靈活性等值綜合打分，評估其親和力，最終給出親和能打分，這種親和能是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)，是AutoDock Vina軟件的核心參數(shù)，能值越低，二者的結(jié)合效果越好。

采用分子對接的方法將每個受體蛋白與結(jié)合能最低的配體進(jìn)行做圖，即將受體蛋白AKT1與光甘草定配體小分子、受體蛋白CASP3與黃芩素配體小分子、受體蛋白IL6與槲皮素配體小分子、受體蛋白VEGFA與3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定配體小分子之間的結(jié)合模式做圖。圖A為受體蛋白AKT1與光甘草定配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Asp292與光甘草定配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基 Glu278、Glu234、Gly157、Lys158、Val164、Gly159、Lys179、Phe161、Leu181、Thr195、Ile186、Glu191、His194與光甘草定配體小分子形成疏水相互作用。圖B為受體蛋白CASP3與黃芩素配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Arg64、Arg207、Gln161、His121與黃芩素配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Ser120、Ala162、Glu123、Cys163、Ser205、Trp206與黃芩素配體小分子形成疏水相互作用。圖C為受體蛋白IL6與槲皮素配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Asp34、Arg179與槲皮素配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘Gln175、Leu33、Arg30、Leu178與槲皮素配體小分子形成疏水相互作用。圖D為受體蛋白VEGFA與3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Cys61、Asn62、Cys57、Asp63與3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Cys60、Gly59、Gly58、Cys68、Glu67、Leu66、Lys107、Glu64與3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定配體小分子形成疏水相互作用。

表2 鼻咽解毒膠囊主要活性成分與對應(yīng)作用靶點(diǎn)的分子對接

3 討論

鼻咽癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病病因可能與EB 病毒感染、遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)［8-10］。目前，治療鼻咽癌的主要手段為放療，但是放射線對人體細(xì)胞缺乏選擇性，不但能殺滅癌細(xì)胞，還能殺滅正常細(xì)胞，損害機(jī)體的免疫功能。近年來，中藥復(fù)方及單體有效成分的抗腫瘤作用越來越受到學(xué)者們的重視。鼻炎解毒膠囊是黃連、黃芩、黃芪、白花蛇毒草和甘草五味藥制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、扶正培本之功效，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法對其體內(nèi)作用機(jī)制進(jìn)一步闡明。

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Pattern diagram of molecular docking

通過數(shù)據(jù)庫篩選得到鼻炎解毒膠囊主要活性成分156個，治療鼻咽癌的交集靶點(diǎn)128個，通過中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，degree排名靠前成分主要有槲皮素、漢黃芩素、山奈酚、黃芩素等。槲皮素具有多方面的生理活性，如抗炎［11］、抗癌［12］、抗病毒［13］、抗氧化［14］、預(yù)防和治療心腦血管疾?。?5］等。漢黃芩素可能通過抑制XIAP、Survivin、Bcl-2表達(dá)及促進(jìn)Bax表達(dá)而發(fā)揮抑制鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［16］。山奈酚能抑制多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤組織的侵襲及轉(zhuǎn)移［17］。黃芩素可以通過下調(diào)EB病毒蛋白EBNA1的表達(dá)，從而抑制EBV陽性鼻咽癌細(xì)胞的增殖生長。說明鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌可能是通過多種成分共同調(diào)控的。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析，degree排名靠前的靶點(diǎn)有AKT1、CASP3、IL6、VEGFA，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT1）是一種抗凋亡蛋白激酶，其底物之一是鼠雙微體（2MDM2）蛋白，在細(xì)胞核中下調(diào)p53活性，從而在腫瘤的發(fā)生中起著重要作用。胱天蛋白酶 -3（Caspase 3，CASP3）是一種重要的凋亡成分，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化是一系列胱天蛋白酶活化并水解底物的結(jié)果，其異常功能或許在癌癥發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［18］。白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）在EBV感染患者鼻咽組織巨噬細(xì)胞中表達(dá)，G等位基因是鼻咽癌復(fù)發(fā)的保護(hù)基因，IL6-634基因的GG基因型與鼻咽癌復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)［19］。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）常通過觸發(fā)血管反應(yīng)引起病理障礙，包括組織水腫和病理血管生成［20］，VEGF-2578 C等位基因攜帶者患鼻咽癌的風(fēng)險顯著，VEGF-2578 C等位基因攜帶者與腫瘤大小和晚期腫瘤分期之間存在顯著相關(guān)性［21］。分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)15種配體小分子均與受體蛋白AKT1、CASP3、IL6、VEGFA中的氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌主要通過核染色、蛋白激酶復(fù)合物、整聯(lián)蛋白結(jié)合、MAP激酶活性等過程，這些過程在治療鼻咽癌作用靶點(diǎn)和作用通路上均有所體現(xiàn)。KEGG富集通路中，主要涉及多物種細(xì)胞凋亡通路、催乳素信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥機(jī)制等作用通路。本研究結(jié)果提示鼻咽解毒膠囊可能通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮藥理作用起到抗鼻咽癌的作用。下一步將對所預(yù)測的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路進(jìn)行科學(xué)驗(yàn)證。

同時，分子對接發(fā)現(xiàn)鼻咽解毒膠囊中15個主要活性成分槲皮素、漢黃芩素等與四個受體蛋白AKT1、CASP3、IL6、VEGFA有很好的結(jié)合，這些都為鼻咽解毒膠囊治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的方向。