馬金秋，姚得順，王 洋

（唐山市人民醫(yī)院：1.超聲科；2.乳腺外科，唐山 063000）

乳腺癌是一種生物學特性非常異質的惡性腫瘤，根據(jù)組織學、免疫組織化學和分子生物學技術可將其分為不同的亞型。其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）約占所有類型乳腺癌的10%～17%，經(jīng)常出現(xiàn)在年輕女性身上［1］。TNBC主要為基底型乳腺癌，具有侵襲性強、擴散轉移風險大、臨床預后差等特點。乳腺癌的治療方法不盡相同，治療效果的準確評價和療效的早期預測是臨床醫(yī)生關注的焦點［2］。近年來，對比增強超聲在療效評價中的價值得到了廣泛的研究，在動物模型和臨床試驗中表現(xiàn)出良好的早期療效評價［3］。本研究旨在建立TNBC化療模式小鼠MDA-MB-231-9，利用超聲造影監(jiān)測模型小鼠化療過程，從而為早期準確評估和預測TNBC療效提供影像學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般材料MDA-MB-231乳腺癌細胞株。健康Balb/c裸鼠（實驗動物的許可證號碼：SYXK（上海）2011-0113），SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，鼠齡6～8周，體重16～21g。超聲儀器 ：EsaoteMylab90（Esaote，Genoa，Italy）彩色超聲診斷儀。東芝Aplio500彩色彩色多普勒超聲診斷儀。聲諾維（SonoVue，Bracco，Italy），USphereTMPrime（佳匯生物股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 三陰性乳腺癌化療模型建模取制備的MDAMB-231細胞，將200μL細胞懸浮液（1×106細胞/每只裸鼠）皮下注射到每只裸鼠的右腋窩。當腫瘤腫塊約為5×5mm時，隨機分配給實驗組和對照組，每組10～20只小鼠。實驗組在聯(lián)合用藥的前1、3、5天給予，對照組給予生理鹽水。未完成一周治療的裸鼠最終被淘汰。

1.2.2 二維超聲造影評估乳腺癌化療療效所有裸鼠化療模型的評估期為7天。在第1、3、5天給藥前（或正常鹽水）和第7天給藥前，進行對比增強超聲評估。分為實驗組A和對照組A，實驗組B和對照組B。A組使用超聲儀器EsaoteMylab90和超聲顯像造影劑，B組使用東芝Aplio500超聲儀器和Prime造影劑。A組：使用超聲波儀器的探頭LA522EsaoteMylab90和機器的參數(shù)進行調(diào)整，以獲得最佳的顯示效果，腫瘤：機械指數(shù)（MI=0.09）一級，焦點是腫瘤上緣，該增益調(diào)整為只顯示腫瘤邊緣。然后，開始實時超聲造影劑的成像模式，1毫升SonoVue造影劑通過尾靜脈和迅速推注，同時開始啟動計時器和存儲功能，它們存儲圖像動態(tài)對比度在儀器中，時間為2～3分鐘。對比分析軟件采用QontraXt，生成時間強度曲線、峰值強度和峰值時間（TTP）。B組：采用東芝Aplio500超聲儀器探頭14L5，二維超聲對比方式參數(shù)如下：機械指標（MI=0.08）。對造影劑抽吸1mlPrime，快速推注入尾靜脈。使用東芝Aplio500機器的圖像處理功能進行分析。得到峰值強度和TTP。分析兩組上述參數(shù)的差異和治療過程的變化。

1.2.3 病理檢查及分析所有裸鼠均在第7天造影評估后處死，取瘤塊，并行H&E染色、CD31及VEGF免疫組化染色。在H&E染色切片下觀察細胞形態(tài)，CD31及VEGF染色結果以細胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色產(chǎn)物為陽性結果。

1.3 統(tǒng)計方法應用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以P＜0.05為存在顯著性差異，組間比較采用t檢驗，實驗組和對照組間△Peak值比較采用Mann-Whitney U檢驗，相關性分析采用Pearson積矩相關系數(shù)，︱r︱=0～0.19提示極低相關性或者無相關性，0.20～0.39提示低相關性，0.40～0.59，提示中度相關性，0.60～0.79提示強相關性，＞0.80提示極強相關性。

2 結果

2.1 二維超聲造影定量分析最終實驗組A有16只裸鼠，對照組A有5只，實驗組B有8只，對照組B有5只。與對照組相比，實驗組A、B均發(fā)現(xiàn)Peak值呈下降趨勢。第1、3、5天的Peak值在實驗組與對照組間均無明顯統(tǒng)計學差異，在第7天時，兩組間有顯著差異，見表2-1及圖2-1、2-2。第3、5、7天的Peak值減去第1天的Peak值得到△PeakD3-D1、△PeakD5-D1與△PeakD7-D1值，實驗組B與對照組B之間的△PeakD3-D1、△PeakD5-D1、△PeakD7-D1均有顯著性差異，說明用B組方法觀察到的實驗組Peak值遞減的幅度大于對照組Peak值遞增的幅度，而實驗組A與對照組A之間三者無明顯差異，見表2-2。

與對照組相比，實驗組A和B的峰值均呈現(xiàn)下降趨勢，而對照組呈現(xiàn)上升趨勢。第7天實驗組與對照組有顯著差異，見表2-1。將實驗組和對照組之間的值進行比較，我們發(fā)現(xiàn)有顯著差異的△PeakD3-D1、△PeakD5-D1與△PeakD7-D1值，說明用B組方法觀察到的實驗組Peak值遞減的幅度大于對照組Peak值遞增的幅度，而實驗組A與對照組A之間三者無明顯差異，見表2-2。

表2 -1 實驗組與對照組間Peak值的對比及變化

表2 -2 實驗組與對照組間△Peak值的比較與變化

實驗組A的TTP值在前1、3、5、7天呈上升趨勢，對照組A的TTP值呈下降趨勢。然而，除第一天（P=.002）外，兩組間TTP無顯著差異，如表2-3所示。實驗組B的TTP值在1、3、5處呈現(xiàn)上升趨勢，在7處異常急劇下降。對照組B的TTP值沒有明顯的趨勢變化。

表2 -3 實驗組與對照組間TTP值的對比與變化

2.2 病理結果分析在H&E彩色切片下，可以看到大面積的乳腺癌細胞和血管，也可以看到一些壞死斑塊。實驗組和對照組的CD31和VEGF免疫組化分析結果如表2-4所示。與實驗組相比，實驗組CD31免疫組化信號的平均面積明顯減小，方法B的累積光密度在實驗組和對照組之間存在差異；此外，實驗組免疫組化信號VEGF的平均表面積和累積光密度均有所下降（P＜0.05）。

表2 -4 實驗組與對照組間免疫組化定量分析與比較

2.3 二維超聲造影與免疫組化的相關性分析如表2-5所示，對第7天的峰值、△PeakD7-D1和免疫組化水平CD31和VEGF進行相關性分析，未發(fā)現(xiàn)顯著相關性。第七天Peak值、△PeakD3-D1、△PeakD5-D1、△PeakD7-D1與免疫組化的相關性分析，可見Peak值與CD31（Area-p）、VEGF（Area-p）、VEGF（IOD）值均表現(xiàn)出極強相關性（r＞0.80，P＜0.05），△PeakD7-D1與CD31（Area-p）、VEGF（IOD）值間具有強相關性，與 CD31（IOD）、VEGF（Area-p）值間具有中等相關性。

3 討論

1971年，F(xiàn)olkman和其他研究人員提出了“腫瘤生長和轉移依賴于新血管形成”的概念，為腫瘤的治療提供了新的思路。據(jù)此已經(jīng)開發(fā)出抑制腫瘤血管生成的靶向抗腫瘤藥物，如Beva單克隆抗體等。多項研究表明乳腺癌是一種高度異質性疾病，侵襲性強，預后差，組織病理學的復雜性，使得細胞形態(tài)學評估非常困難［4-5］。研究表明，乳腺癌治療后腫瘤血流動力學的變化比形態(tài)學的變化要早得多。因此，腫瘤組織微血管功能的評估對于乳腺癌治療的早期評估是很有價值的［6］。

表2 -5 二維超聲造影與免疫組化分子表達的相關性分析

使用SonoVue造影劑的增強造影劑可以檢測直徑約為40μm的病變。因此，對比增強超聲也被認為是一種檢測血管生成變化的成像方法，對比增強超聲相對增強CT，便宜、靈敏度低、安全，且可重復使用。造影劑在損傷區(qū)域的最大灌注時間與血流速度有關。微血管密度越高通常表明血液流動更快，這反過來又會使造影劑更快地進入損傷區(qū)域［7］。本研究實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，第7天實驗組的最大值明顯較低，表明該最大值可以預測乳腺癌化療的療效。許多研究證實，新輔助治療后，乳腺癌病變的灌注強度顯著降低，表明最大灌注強度是化療療效的指標［8］。實驗研究小組使用了乳腺癌細胞mcf來評估植入的有效性，通過對比后發(fā)現(xiàn)，超聲造影第一次劑量后，實驗組的最大強度明顯降低，且二次劑量后，實驗組的最大強度很小，相對溫和，但在整個治療周期后，實驗組和對照組的最大強度存在顯著差異。超聲波造影劑是一種六氟化硫（SF6）微氣泡，由磷脂和聚乙二醇包裹，平均直徑2-3μm。它也是一種常用的臨床造影劑?？梢愿纳迫橄俨∽冄苄纬傻挠跋駥W效果，使定性診斷更加準確［9］。

USphere超聲微泡臨床造影劑為單層膜微泡，以八氟丙烷氣體（C3F8）為芯氣，磷脂物質為外膜。磷脂層可以形成一層保護膜，有效減緩氣體擴散，防止微氣泡融合成更大的氣泡，并在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)，提高成像時間［10-11］。本文使用超聲診斷儀器百勝Mylab90及造影劑SonoVue，并使用了東芝Aplio500及造影劑來完成定量分析。結果表明，只有二維對比超聲定量參數(shù)的峰值具有提示意義，但在第7天峰值與最終的MVD和VEGF比較中，其表達水平有了高度相關，所以使用超聲診斷儀器東芝Aplio500和造影劑改良的二維超聲略優(yōu)于對照組方法。

在此次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)對比增強超聲不能檢測早期腫瘤的血流動力學變化。與ct、mri和pet相比，對比增強超聲只能顯示腫瘤的一個切面，這很容易導致對整個腫瘤血管生成的評估出現(xiàn)錯誤。同時，本部分實驗中對比增強超聲參數(shù)與定量免疫組化分析的相關性不高，需要更靈敏的分子超聲成像技術，才能在其他實驗中專門針對VEGFR-2進行有效評估。目前，二維超聲分子成像已被證明是非常有效的，在監(jiān)測抗血管腫瘤治療方面具有較高的有效性［12］。