朱 娟，周 英，唐少華

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410013；2.長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410004）

急性髓性白血?。ˋcute Myeloid Leukemia，AML）是急性白血病中常見(jiàn)的類型之一，是臨床髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，其主要特征為骨髓、外周血中原始及幼稚髓樣細(xì)胞發(fā)生異常增生［1］。成人總體發(fā)病率75.3/10萬(wàn)人，死亡率53.4/10萬(wàn)人，發(fā)病率及死亡率在成人所有惡性腫瘤中位居第13位和第9位［2］。因此，研究AML發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，提高AML的生存率，具有重要的臨床意義。

微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類長(zhǎng)度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，約22nt，通過(guò)5’端6～8個(gè)序列（種子序列）與其靶基因的mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域（3’UTR）互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控［3］。miRNA可導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，從而進(jìn)一步調(diào)控多種生物學(xué)行為如發(fā)育的進(jìn)程、干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、疾病以及腫瘤發(fā)生等［4］。研究表明，miR-186在慢性淋巴細(xì)胞白血病、自身免疫溶血性貧血、多發(fā)性骨髓瘤以及AML患者中均有表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［5］，但其具體機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)miR-186在AML細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 骨髓標(biāo)本收集中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院和長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院2018年8月～2019年8月血液科初診為AML的患者骨髓標(biāo)本（60例）。另外收集了20例正常供者骨髓標(biāo)本作為正常對(duì)照。所有標(biāo)本的使用獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意和患者或家屬的知情同意。

1.2 主要試劑TRIZOL購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自羅氏公司，MTT試劑盒購(gòu)自Sigma公司，mimicmiR-186和inhibitor-miR-186購(gòu)自上海吉瑪基因公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司，EZH2及GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)人AML細(xì)胞HL60及人胚胎腎細(xì)胞HEK293購(gòu)買自美國(guó)菌種保藏中心。兩種細(xì)胞均置于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10% FBS和1%青霉素/鏈霉素，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 熒光定量PCR使用TRIZOL提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所有操作按試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行。使用LightCycler 480熒光定量PCR儀檢測(cè)基因的表達(dá)，反應(yīng)條件按熒光定量PCR試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。熱循環(huán)參數(shù)為：95℃ 10s，然后95℃5s，60℃ 10s，72℃ 10s，共 45 個(gè)循環(huán) ；最后72℃延伸5min。定量PCR每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。內(nèi)參用U6或GAPDH。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參）-對(duì)照組（Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參）。各基因及其內(nèi)參的擴(kuò)增引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)HL60細(xì)胞增殖能力。將目的細(xì)胞消化后接種到96孔板，每個(gè)孔接種約3000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣品接種3個(gè)孔，分別加入不同濃度阿霉素（0、0.1、1、2、5、10μg/mL）。培養(yǎng)箱中孵育24h后每個(gè)孔內(nèi)加入10μL的MTT試劑。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h后，450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集各組轉(zhuǎn)染或/和阿霉素處理的細(xì)胞，PBS洗2次。用100μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10 min。加入5μL的Annexin V-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)FITC熒光和PI熒光，分析細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.7 靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶試驗(yàn)通過(guò)starBase工具（http：//starbase.sysu.edu.cn/）預(yù)測(cè)miR-186與EZH2結(jié)合的位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果，分別設(shè)計(jì)和合成結(jié)合位點(diǎn)的野生序列和突變序列（mut-EZH2和wt-EZH2）。分別將結(jié)合位點(diǎn)的野生序列和突變序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體（pGL3-Basic）中，再分別與 miR-186 mimic（30 nM）或陰性對(duì)照（30 nM）共轉(zhuǎn)染HEK239T細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后檢測(cè)各組Firefly熒光素酶活性和Renilla熒光素酶活性，Renilla熒光素酶活性作為內(nèi)參，F(xiàn)irefly熒光素酶與Renilla熒光素酶活性的比值為熒光素酶的相對(duì)活性。

1.8 Western blot使用RIPA裂解液（碧云天，上海，中國(guó)）裂解細(xì)胞，獲得蛋白樣品。利用BCA試劑盒（碧云天）測(cè)量蛋白濃度后，取相應(yīng)體積的蛋白加入上樣緩沖液（碧云天）混勻，沸水浴加熱3min，使蛋白變性。80 V電泳30min，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用120 V，電泳1～2 h。轉(zhuǎn)膜在冰浴中進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜電流為300mA，時(shí)間為60min。轉(zhuǎn)膜后把膜放入洗滌液中漂洗1～2min，再將膜放入封閉液中室溫封閉60min，或者4℃封閉過(guò)夜。室溫下，搖床上孵育一抗GAPDH、EZH2 1h，洗滌液洗滌3次，每次10 min。轉(zhuǎn)入二抗中，室溫下孵育1小時(shí)，洗滌3次，每次10min。在膜上滴加顯影液后，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-rad）進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式展示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用One-way analysis of variance（ANOVA）檢驗(yàn)。骨髓標(biāo)本中 miR-186 表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜ 0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML中miR-186呈低表達(dá)狀態(tài)，而EZH2呈高表達(dá)狀態(tài)熒光定量PCR檢測(cè)臨床AML患者及對(duì)照組（健康志愿者）骨髓miR-186及EZH2的表達(dá)。結(jié)果顯示：相較于健康志愿者，AML患者骨髓的miR-186明顯下調(diào)（圖1A），EZH2的mRNA水平顯著升高（圖1B）。

圖1 miR-186與EZH2在健康志愿者和AML患者中的表達(dá).（A）miR-186的相對(duì)表達(dá)量 ；（B）EZH2的相對(duì)表達(dá)量.**：與健康志愿者比較，P＜0.01

2.2 miR-186抑制HL60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡在HL60細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染mimic-NC，mimic-miR-186，inhibitor-NC，inhibitor-miR-186，分別培養(yǎng)24，48，72h后，利用MTT法檢測(cè)HL60細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明：72h后，mimic-miR-186組的OD值明顯低于mimic-NC組（圖2A），inhibtor-miR-186組的OD值明顯高于inhibitor-NC（圖2B）。

同樣，將上述各分組細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：mimic-miR-186組的凋亡率高于mimic-NC組，inhibitor-miR-186組的凋亡率低于inhibitor-miR-186（圖2C）。以上結(jié)果表明，miR-186抑制HL60細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

圖2 miR-186抑制HL60細(xì)胞增殖，促進(jìn)HL60細(xì)胞凋亡.細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic-NC和mimic-miR-186后的增殖變化（A）和細(xì)胞凋亡變化（C）；細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor-NC和inhibitor-miR-186后的增殖變化（B）和細(xì)胞凋亡變化（D）*：mimic-miR-186與mimic-NC比較，P＜0.05

2.3 miR-186與EZH2靶向結(jié)合針對(duì)Starbase中預(yù)測(cè)的miR-186與EZH2結(jié)合位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)合成了結(jié)合位點(diǎn)的野生序列（wt）和突變序列（mut）（圖3A），并插入熒光素酶報(bào)告基因載體中，驗(yàn)證miR-186與EZH2的靶向結(jié)合。結(jié)果顯示，插入EZH2突變序列mut-EZH2后，共轉(zhuǎn)染mimic-miR-186和mimic-NC熒光素酶活性沒(méi)有差異；而插入EZH2野生序列wt-EZH2序列后，共轉(zhuǎn)染mimic-miR-186熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染mimic-NC（圖3B，P＜ 0.05）。這一結(jié)果表明，miR-186可與EZH2相結(jié)合。

圖3 miR-186與EZH2靶向結(jié)合的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證.（A）利用Starbase預(yù)測(cè)miR-186與EZH2的結(jié)合位點(diǎn)；（B）熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-186與EZH2的結(jié)合。mimic-miR-186與mimic-NC比較，**P＜0.01

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)相比于健康志愿者，miR-186在AML患者中低表達(dá)，EZH2在AML患者中高表達(dá)。通過(guò)在HL60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimic-miR-186和inhibitor-miR-186對(duì)miR-186進(jìn)行過(guò)表達(dá)及敲低，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)miR-186抑制HL60細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡。且miR-186與EZH2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)方法在線預(yù)測(cè)miR-186與EZH2有靶向結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，證明兩者之間存在靶向結(jié)合的關(guān)系。以上結(jié)果表明，miR-186通過(guò)抑制EZH2的表達(dá)發(fā)揮抑制AML腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

PRC（Polycomb Repressive Complex）可以通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路在哺乳細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-7］。PRC2是調(diào)控干細(xì)胞活性的關(guān)鍵分子，PRC2的異常表達(dá)與包括白血病、胃癌等多種類型的腫瘤密切相關(guān)［8-9］。EZH2是PRC2最重要的催化亞基，參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、分化等多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)事件［10］。據(jù)報(bào)道，EZH2與乳腺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、AML等腫瘤細(xì)胞增殖凋亡密切相關(guān)［11-14］。有臨床研究顯示：EZH2的表達(dá)與AML病人的不良預(yù)后密切相關(guān)，并調(diào)控腫瘤干細(xì)胞調(diào)控關(guān)鍵分子，包括Wnt/β-catenin、Notch、STAT3等信號(hào)通路［15］。

MiR-186是miRNAs的成員之一，位于染色體1p31.1，在鋅指蛋白265基因的第8個(gè)內(nèi)含子處，在包括非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、胃癌等多種實(shí)體瘤中表達(dá)下調(diào)［16-18］，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。miR-186在慢性淋巴細(xì)胞白血病、自身免疫溶血性貧血、多發(fā)性骨髓瘤以及AML患者中同樣表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［19］。生物信息學(xué)研究顯示，miR-186可以靶向EZH2。

我們研究的結(jié)果還表明，EZH2和miR-186在大多數(shù)患者中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但并不是在所有的患者中，表明除了EZH2，miR-186還會(huì)有其它潛在的未被發(fā)現(xiàn)的靶基因，一個(gè)miRNA調(diào)控多個(gè)基因，而一個(gè)基因受多個(gè)miRNA調(diào)控，因此形成了復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，本研究通過(guò)在AML中研究miR-186的表達(dá)和功能，miR-186通過(guò)靶向結(jié)合EZH2并抑制其表達(dá)，抑制HL60細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，起到抑癌的作用，為miR-186有可能成為AML治療的新思路提供了理論依據(jù)。