李新華，袁 泉，岳志勁，劉永文

（山西大同大學化學與化工學院，山西大同 037009）

司帕沙星是第三代喹諾酮類抗菌藥，其藥理作用是通過阻礙細菌的DNA合成而產(chǎn)生殺菌作用，對多種細菌有強大抗菌作用，因此對微生物感染的相關(guān)疾病都有良好的治療作用，主要用于呼吸、泌尿、腸道、膽道、皮膚軟組織等感染。目前，測定司帕沙星含量的方法主要有毛細管電泳高頻電導法[1]、流動注射化學發(fā)光法[2]、高效液相色譜法[3]、熒光猝滅法[4]、紫外分光光度法[5]等，但未見司帕沙星與甲基紅反應形成荷移絡合物的褪色光度法測定司帕沙星含量的報道。

以甲基紅為顯色劑，通過其與司帕沙星作用，使甲基紅發(fā)生明顯的褪色反應[6-11]，根據(jù)吸光度值的降低來測定司帕沙星藥片中的司帕沙星含量。該法簡單、快速、靈敏，無需昂貴的儀器及試劑，與文獻比較結(jié)果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

FA2204 電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司)；722E 分光光度計、PHS-3C 型精密酸度計（上海大普儀器有限公司）；HH-2 恒溫數(shù)顯水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.00× 10-3mol/L 司帕沙星儲備液：取0.039 2 g司帕沙星對照品（含量99.8%，中國藥品生物制品鑒定所），用無水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶，并用黑色塑料膜包裹，避光保存，用時用無水乙醇稀釋至所需濃度。

1.00× 10-3mol/L 甲基紅溶液：取0.026 9 g 甲基紅，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，用時用無水乙醇稀釋至所需濃度。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液：取5.90 mL 冰醋酸稀釋至500 mL，配成0.2 mol/L 的醋酸溶液；取13.808 g 醋酸鈉，稀釋至500 mL，配成0.2 mol/L 的醋酸鈉。以不同比例配成不同pH值的緩沖溶液。

其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

司帕沙星片（大同五洲通制藥有限責任公司）為市售品，批號20190401，規(guī)格0.1 g×6片。

1.2 實驗方法

在10 mL 的容量瓶中加入4.00 mL 的1.00×10-4mol/L甲基紅溶液和1.00 mL pH=3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，再加入一定量的司帕沙星儲備液，加水定容，搖勻。靜置10 min，用1 mL 的比色皿測定吸光值（λ=553 nm），計算ΔA=A0-A。其中A0為空白試劑的吸光度值，A為含有司帕沙星的試劑的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜與機理討論

用SP-722E 型分光光度計，分別對甲基紅-司帕沙星溶液（以空白試劑為參比）和甲基紅溶液、司帕沙星溶液、甲基紅-司帕沙星溶液（以水為參比），在320～700 nm 波長范圍內(nèi)進行測定，得到吸收光譜曲線（圖1）。由圖1 可知，當以水為參比時甲基紅在530 nm 處有最大吸收峰（曲線a）；而司帕沙星相對水而言溶液幾乎沒有吸收（曲線c）；向甲基紅溶液中加入司帕沙星溶液之后，吸光值降低，波峰藍移至510 nm處，在350～500 nm 之間較不加入司帕沙星溶液的吸光值高，在500～630 nm 之間的吸光值較不加入司帕沙星溶液的吸光值低（曲線b）；以試劑空白為參比時，加入司帕沙星的甲基紅溶液在553 nm 處形成波谷（曲線d）。以上事實表明，甲基紅與司帕沙星在波長500～630 nm之間發(fā)生了褪色反應。

圖1 司帕沙星-甲基紅體系的吸收光譜

司帕沙星對甲基紅褪色反應的機制可能是由于司帕沙星的分子結(jié)構(gòu)中-F 富電子，可作為給電子體；甲基紅中苯環(huán)的羧基及鄰位的氮氮雙鍵的相互作用，使兩個苯環(huán)電子云密度降低，苯環(huán)缺電子，可作為受電子體。因此，在pH=3.5 的條件下，甲基紅中缺電子的苯環(huán)與司帕沙星中富電子的-F 通過電荷荷移形成1∶1 的絡合物[11]（配位比的測定用等摩爾系列法）。反應機理見圖2。

圖2 反應機理

2.2 實驗條件的選擇

以試劑空白為參比，553 nm 為測定波長，以4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標準溶液為實驗條件進行優(yōu)化。

2.2.1 甲基紅濃度和用量的影響

選取10 個10 mL 的容量瓶，分為A、B 2 組，其中A 組作為空白對照。在A、B 組中分別加入1.00×10-4mol/L 甲基紅溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，再依次加入1.00 mL 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=3.5)，然后在B 組溶液中加入4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標準溶液2.00 mL。按照2.2 節(jié)的實驗方法測定ΔA，結(jié)果見圖3。由圖可知，當甲基紅的用量在1.00～4.00 mL(即甲基紅的濃度為1.00×10-5～4.00×10-5mol/L)時，溶液的吸光度降低值ΔA隨甲基紅的用量增加而增大；當甲基紅的用量為在4.00～5.00 mL(即甲基紅的濃度為4.00×10-5～5.00×10-5mol/L)時，溶液的吸光度降低值ΔA隨甲基紅的用量增加而降低。這可能是因為甲基紅與司帕沙星締合后，過量的甲基紅溶液使締合物的吸光值受到影響。因此，本實驗選擇甲基紅的用量為4.00 mL，即甲基紅溶液的濃度為4.00×10-5mol/L。

圖3 甲基紅濃度的影響

2.2.2 緩沖溶液和pH的探討

實驗比較了醋酸-醋酸鈉、Britton-Robinson（BR）、KH2PO4-NaHPO4（PB）、鹽酸-醋酸鈉、六次甲基四胺和檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為實驗的反應介質(zhì)，對甲基紅與司帕沙星荷移絡合物反應的影響情況。結(jié)果表明，PB 緩沖體系有渾濁出現(xiàn)，透光度不好；在六次甲基四胺緩沖溶液中無明顯褪色現(xiàn)象；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液褪色現(xiàn)象不明顯，ΔA較小；BR、鹽酸-醋酸鈉、醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中褪色現(xiàn)象最為明顯，且三者吸光度下降值ΔA的差值很小。

環(huán)境的酸堿性對司帕沙星與甲基紅荷移絡合物解離影響較大，進而影響到二者的締合。因此，本實驗首先考慮緩沖體系的pH值對褪色現(xiàn)象的影響。在酸性堿性中性的緩沖體系下分別做定性實驗，可知在酸性緩沖體系下甲基紅與司帕沙星有褪色現(xiàn)象，因此，選定酸性緩沖體系進行實驗。

選用20個10 mL的容量瓶分為2組，一組作為空白試劑，在20 個10 mL 的容量瓶中，依次加入1.00×10-4mol/L 甲基紅溶液4.00 mL、pH 在1.0～5.5 的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液1.00 mL，然后在另一組溶液加入4.00×10-6mol/L的司帕沙星標準溶液2.00 mL，2組溶液均用蒸餾水定容至10 mL。按照2.2 節(jié)實驗方法測定ΔA，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，當醋酸－醋酸鈉緩沖溶液的pH=3.5 時，ΔA值最大，褪色現(xiàn)象最明顯。同時本實驗還考察了緩沖液用量對荷移反應的影響情況。結(jié)果表明，當移取量為1.00 mL時，褪色現(xiàn)象最明顯，ΔA值最大。因此，本實驗中緩沖溶液的最佳條件為移取1.00 mL pH=3.5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液。

圖4 pH的影響

2.2.3 表面活性劑的影響

試驗了陰離子型和陽離子型表面活性劑及非離子表面活性劑對甲基紅－司帕沙星荷移反應的影響情況。結(jié)果表明，十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基三甲基銨和曲拉通X－100 對測定結(jié)果的影響較小，因此，實驗中不加入任何類型的表面活性劑。

2.2.4 溫度和時間的影響

（1）時間對褪色作用的影響

室溫下，在不同的反應時間10、20、30、40、50 min里，分別對吸光度降低值ΔA進行測定，結(jié)果顯示，對應的ΔA為0.386、0.386、0.394、0.397、0.397。由此可見，司帕沙星與甲基紅荷移反應10 min 時ΔA為0.386，此后隨著時間的延長ΔA增加不是太大，因此，實驗選擇10 min作為反應時間。

（2）溫度對褪色作用的影響

在15、25、35、45、55、65 ℃分別對吸光度降低值ΔA進行測定，結(jié)果顯示，ΔA值分別為0.380、0.380、0.360、0.342、0.330、0.314?？梢姡敎囟葹?5～25 ℃之間時，吸光度降低值ΔA幾乎不變化；當溫度在25～65 ℃之間時，ΔA隨溫度的升高逐漸降低。因此，實驗選擇在室溫下進行。

2.2.5 加樣順序?qū)嶒灲Y(jié)果的影響

甲基紅和醋酸－醋酸鈉緩沖溶液加樣順序?qū)y定結(jié)果的影響。試驗結(jié)果表明，先加甲基紅溶液然后與醋酸－醋酸鈉緩沖溶液混合后再加入司帕沙星溶液作為加樣順序效果最佳。

3 干擾試驗

在所選擇的實驗條件下，用4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標準溶液進行干擾實驗，考察了常見藥物添加劑及常見離子（分子）對該測定方法的影響情況。結(jié)果表明，當向4.00×10-6mol/L 的司帕沙星標準溶液中分別加入淀粉、葡萄糖、賦形劑滑石粉、蛋白質(zhì)、硬脂酸鎂、糊精、組氨酸、色氨酸和乳糖及一些常見金屬離子（Na+、K+、NH4+、Al3+、Ca2+、NO3-、Cl-、Cu2+、Fe3+、Pb2+）實驗表明，一定量的常見金屬離子、無機酸根離子、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸對司帕沙星測定的結(jié)果影響較小，相對誤差均小于5%。所以，本法具有較高的選擇性，可用于實際樣品的測定。

4 標準曲線的繪制

分別取1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00、2.20、2.40、2.60、2.80、3.00 mL 1.00×10-5mol/L 司帕沙星乙醇溶液加入10 mL容量瓶中，按照上述的實驗方法對其進行測定，繪制出標準工作曲線見圖5。

圖5 司帕沙星標準工作曲線

ΔA與司帕沙星的濃度在1.00×10-6～3.00×10-6mol/L 范圍內(nèi)呈線性，線性方程為ΔA=0.14936c+0.09909，r2=0.997。計算出表觀摩爾吸光系數(shù)為K=2.10×105L/（mol?cm）。再做20次空白實驗，對其進行連續(xù)測定，求出標準偏差δ=1.00×10-3，按檢出限的計算公式CLOD=3×δ/K，求得檢出限D(zhuǎn)=6.00×10-7mol/L。

5 實際樣品的測定

5.1 司帕沙星試樣的制備

稱取0.239 4 g 司帕沙星片劑，研磨均勻，用乙醇溶解，抽濾，洗滌，除去不溶物，定容于250 mL容量瓶中，搖勻，備用。再取1 mL稀釋到100 mL容量瓶中。

5.2 試樣的測定

取2.00 mL 的試樣溶液于10 mL 容量瓶中，用上述1.2 節(jié)的實驗方法進行測定，對照工作曲線求得2.00 mL 中司帕沙星的含量，然后加入一定量的司帕沙星標準溶液，進行回收率測定，結(jié)果見表1。

表1 藥物制劑中司帕沙星含量的測定及回收率

6 結(jié)論

試驗了司帕沙星與甲基紅在酸性條件下形成荷移絡合物，在波長553 nm條件下，發(fā)生褪色反應的各種適宜條件。結(jié)果表明，在pH=3.5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中，當依次加入4.00 mL濃度為1.00×10-4mol/L的甲基紅溶液、1.00 mL的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液和一定量的司帕沙星溶液，常溫下放置10 min 左右，此時甲基紅與司帕沙星已完全荷移，使甲基紅溶液發(fā)生明顯的褪色現(xiàn)象，體系非常穩(wěn)定，且在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。司帕沙星與甲基紅溶液反應形成配位比1∶1的荷移絡合物，本實驗測定了藥物制劑中司帕沙星的含量，其相對標準偏差RSD=1.52%，回收率為101.5%。該方法操作簡單、可靠性強、具有較高的精密度和準確度，可用于準確測定藥劑中司帕沙星的含量。