李容榕，盛觀星，林小艷

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海西寧 810007；2.青海省青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810007）

羌活，又稱(chēng)“護(hù)羌使者”，為傘形科羌活屬植物羌活Notopterygium incisum Ting exH.T.Chang或?qū)捜~羌活Notopterygium foriesii Boiss的干燥根莖[1]。羌活為常用中、藏藥材，許多中、藏醫(yī)典籍均有記載，其味辛、苦，性溫，具有解表散寒、祛風(fēng)除濕、止痛活血等功效。臨床用于改善胃腸消化吸收功能、治療婦科疾病、風(fēng)寒感冒、頭痛項(xiàng)強(qiáng)、風(fēng)濕痹痛等病證[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究，羌活具解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、增加腦血流量、抗血小板凝集、抗心肌缺血、抗心律失常、抗哮喘、抗海洋污損活性等作用[3-9]。羌活化學(xué)成分種類(lèi)繁多、成分復(fù)雜，主要含有揮發(fā)油和香豆素類(lèi)化合物，此外還有氨基酸、有機(jī)酸、多糖、微量元素等[10-12]。

AOE 即植物抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等，是普遍存在于植物各種組織中的復(fù)合酶系。與植物的代謝強(qiáng)度及逆境適應(yīng)能力有密切關(guān)系，經(jīng)常被用來(lái)衡量植物的抗性強(qiáng)弱和衰老程度。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥材，經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院林鵬程教授鑒定，為傘形科羌活屬植物羌活及寬葉羌活。2018 年6-8 月分別采自青海省互助北山林場(chǎng)（2 種）、大通縣、祁連縣3個(gè)地區(qū)，4種。棄去植株根部以上部位，用純水沖洗根部、陰干，粉碎，過(guò)40目篩，備用。

甲醇（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；RO純水（自制）。96T 植物抗氧化酶（AOE）活性酶聯(lián)免疫分析試劑盒（江蘇麥莎實(shí)業(yè)有限公司，LOT NO：18112808H）。

1.2 儀器

FLUOstar Omega 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG LABTECH 公司）；GZX-9076MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；UPHIV-10T 型優(yōu)普系列超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；AL204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KDM 型調(diào)溫電熱套（西安森海石油設(shè)備有限公司）；Spe-ed SFE-4 超臨界流體萃取裝置（美國(guó)ASI應(yīng)用分離公司）；FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；SDC-6 型低溫恒溫槽（南京新辰生物科技有限公司）；揮發(fā)油提取器（上海申玻儀器公司）；40 目標(biāo)準(zhǔn)篩（紹興市上虞新達(dá)凈化儀器廠）。

2 方法

2.1 羌活揮發(fā)性成分提取

超臨界CO2萃取法：取備用樣品20 g 置于超臨界CO2萃取釜中，壓力360 MPa、溫度50 ℃條件下，靜態(tài)萃取15 min，動(dòng)態(tài)萃取45 min，得不同地區(qū)羌活萃取物。

水蒸氣蒸餾法：取備用樣品20 g 置于圓底燒瓶中，按照《中國(guó)藥典（2015 版）》揮發(fā)性成分提取項(xiàng)下儀器組裝，進(jìn)行提取。

提取得率、顏色等狀態(tài)詳見(jiàn)表1。

表1 不同地區(qū)羌活揮發(fā)性成分顏色及提取率

2.2 樣品處理

取上述提取所得揮發(fā)性成分（編號(hào)QH1-QH8）適量于70%甲醇中，配制為5.0 mg/mL溶液，備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取所購(gòu)買(mǎi)植物抗氧化酶（AOE）試劑盒中原倍標(biāo)準(zhǔn)品，按照表2進(jìn)行稀釋。

分別設(shè)空白孔與標(biāo)準(zhǔn)孔。在酶標(biāo)包被板上，標(biāo)準(zhǔn)孔內(nèi)分別準(zhǔn)確加入1號(hào)至5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動(dòng)混勻。

封板膜封板后置于37 ℃環(huán)境中溫育30 min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

洗滌結(jié)束后，空白孔除外，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL。用封板膜封板置37 ℃環(huán)境中溫育30 min。取出，揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

洗滌結(jié)束后，每孔中先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，震蕩混勻，37 ℃避光環(huán)境中溫育、顯色15 min 后，每孔中加入終止液50 μL，終止顯色反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色。

孔板置于酶標(biāo)儀，調(diào)零，反應(yīng)終止15 min 內(nèi)，450 nm 波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性回歸方程式。

2.4 樣品測(cè)定

待測(cè)樣品孔中加入樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL。后續(xù)步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制的方法。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

植物抗氧化酶（AOE）含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.0813x+0.0245，r2=0.9997。曲線見(jiàn)圖1。

圖1 植物抗氧化酶（AOE）含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

按照上述操作步驟，重復(fù)測(cè)定5 次，結(jié)果顯示待測(cè)樣品的植物抗氧化酶（AOE）含量的RSD為0.7%～1.6%，表明該方法精密度良好。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照上述操作步驟，稱(chēng)取同一待測(cè)樣品5份進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示待測(cè)樣品植物抗氧化酶（AOE）含量的RSD為0.8%～1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 樣品測(cè)定結(jié)果

水蒸氣蒸餾法得揮發(fā)性成分中植物抗氧化酶（AOE）含量較高，超臨界CO2萃取法的揮發(fā)性成分中植物抗氧化酶（AOE）含量較低。各樣品中植物抗氧化酶（AOE）含量見(jiàn)表3。

表3 不同地區(qū)羌活揮發(fā)性成分植物抗氧化酶（AOE）含量表

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：水蒸氣蒸餾得羌活揮發(fā)性成分中植物抗氧化酶含量明顯高于超臨界CO2萃取法所得羌活揮發(fā)性成分。水蒸氣蒸餾羌活揮發(fā)性成分中，不同地區(qū)之間的植物抗氧化酶含量有較大差異，采自青海省互助北山林場(chǎng)的羌活A(yù)OE 含量最高，達(dá)9.99 U/g，其次是祁連縣寬葉羌活、互助北山林場(chǎng)寬葉羌活，采自青海省大通縣的羌活植物抗氧化酶（AOE）含量最低，為5.09 U/g。超臨界CO2萃取得青海省不同地區(qū)羌活揮發(fā)性成分的AOE 含量無(wú)明顯差異，均低于4.00 U/g。

水蒸氣蒸餾法提取得到的羌活揮發(fā)性成分中AOE含量高，超臨界CO2萃取法提取的羌活揮發(fā)性成分AOE 含量較低，且無(wú)明顯地區(qū)差異性。采用不同提取方法、不同提取溶劑選擇，對(duì)提取物成分、含量、狀態(tài)均有明顯影響，尤其對(duì)羌活揮發(fā)性成分AOE 提取率有顯著影響。與超臨界CO2萃取法相比，水蒸氣蒸餾法傳統(tǒng)、經(jīng)典，且提取溶劑是水蒸氣，得到的揮發(fā)性成分中除揮發(fā)油外脂溶性成分含量極低，AOE含量較高。

AOE 含量可以較好地反映出不同地區(qū)羌活抗氧化活性的強(qiáng)弱，同時(shí)反映出不同提取方法對(duì)植物抗氧化酶提取的影響。