沈 俊，陳 瑩，王 鑫，張林艷，顧 兵，裴 兵，楊 歡

1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2蘇州工業(yè)園區(qū)疾病防治中心，江蘇 蘇州 215100；3羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司專(zhuān)業(yè)和分子診斷部，上海 200131；4宿遷市第一人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，江蘇 宿遷 223800

隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中各種疾病的早期診斷對(duì)體外診斷技術(shù)的靈敏度、檢測(cè)限、檢測(cè)速度等性能指標(biāo)提出了越來(lái)越高的要求，這使得許多傳統(tǒng)的、常規(guī)的體外診斷技術(shù)逐漸不能滿足疾病診斷的需要。同時(shí)，隨著“一帶一路”建設(shè)的展開(kāi)和對(duì)外開(kāi)放的進(jìn)一步加深，我國(guó)防控輸入性疾?。?］和對(duì)外醫(yī)療援助［2］的難度與需求也空前增高，不同的應(yīng)用環(huán)境也對(duì)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)的分析速度、檢測(cè)成本、操作難度等提出了各種各樣的要求。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用也引起了越來(lái)越多的關(guān)注和研究。這些基于納米材料的檢測(cè)技術(shù)常常具有高靈敏度、高特異度、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，因而在早期診斷、快速診斷、及時(shí)檢驗(yàn)（point-of-care testing，POCT）等方面具有極大的潛力。此前，李萬(wàn)萬(wàn)等［3］和張?zhí)K琳等［4］分別對(duì)基于納米材料的體外診斷技術(shù)進(jìn)行了介紹，其中前者側(cè)重對(duì)納米材料的介紹；后者側(cè)重于醫(yī)學(xué)研究。本文將對(duì)應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)與診斷領(lǐng)域的常見(jiàn)納米材料，以及近年來(lái)基于納米材料的蛋白、核酸檢測(cè)技術(shù)等方面的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 常見(jiàn)納米材料

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸（0.1～100 nm），或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，具有獨(dú)特的磁性、光學(xué)、熱力學(xué)性質(zhì)等尺寸依賴性理化性質(zhì)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用也引起了越來(lái)越多的關(guān)注。在表面修飾抗體、探針或其他生物識(shí)別元件后，可使納米材料在自身特性的基礎(chǔ)上獲得對(duì)特定檢測(cè)對(duì)象的靶向性。在眾多納米材料中，磁性納米粒（magnetic nanoparticle，MNP）、量子點(diǎn)（guantum dot，QD）和納米金粒子（gold nanoparticles，AuNP）在體外診斷領(lǐng)域的研究較為常見(jiàn)。

1.1 MNP

MNP是一種具有超順磁性的納米材料，即當(dāng)外磁場(chǎng)存在時(shí)，MNP具有磁性，而當(dāng)外磁場(chǎng)撤離時(shí)磁性消失。在MNP上連接單克隆抗體、核酸探針等，靶向捕獲目標(biāo)物質(zhì)后，通過(guò)外加磁場(chǎng)，使目標(biāo)物質(zhì)被吸附而滯留于磁場(chǎng)中，而使其他物質(zhì)被分離。通過(guò)這種磁分離技術(shù)，可達(dá)到在短時(shí)間內(nèi)完成分離和富集的目的，從而提高檢出率。張俊仙等［5］用抗酸染色、普通PCR和磁納米捕獲-PCR方法檢測(cè)確診肺結(jié)核病患者痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果顯示由于結(jié)核分枝桿菌得到濃縮、聚集和純化，除去了不利于PCR擴(kuò)增的抑制因子，磁納米捕獲-PCR技術(shù)的檢測(cè)陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于抗酸染色檢查（27.0%）和普通PCR檢測(cè)（47.4%），達(dá)到了82.9%。此外，徐源［6］、黃偉等［7］團(tuán)隊(duì)也利用MNP的富集純化能力，分別構(gòu)建了對(duì)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）和手足口病腸道病毒的檢測(cè)方法，均具有較為可靠的診斷性能。

1.2 QD

熒光標(biāo)記技術(shù)是指將能發(fā)射熒光的物質(zhì)通過(guò)共價(jià)結(jié)合或物理吸附等方式標(biāo)記于所研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，用它的熒光特性來(lái)反映研究對(duì)象的信息。面世以來(lái)，熒光標(biāo)記技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和特性在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了極為廣泛的應(yīng)用。目前常用的傳統(tǒng)熒光染料主要有熒光素染料、羅丹明類(lèi)染料、菁染料等，在不同的檢測(cè)方法中發(fā)揮著重要作用［8］，但與此同時(shí)，這些染料也存在著光淬滅率高、對(duì)pH值敏感、發(fā)射光譜寬等問(wèn)題。

QD 又稱(chēng)膠體半導(dǎo)體納米晶，是一種具有獨(dú)特光物理性質(zhì)的半導(dǎo)體納米晶，自20 世紀(jì)80 年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)，迅速成為納米科學(xué)和納米技術(shù)的前沿［9］。QD 具有抗光漂白性強(qiáng)、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、不易化學(xué)降解、熒光壽命長(zhǎng)、發(fā)射光的顏色隨粒徑變化等特點(diǎn)［10］，可突破傳統(tǒng)染料的局限性，實(shí)現(xiàn)在同一激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)不同物質(zhì)的檢測(cè)。QD 可用于檢測(cè)各種抗原物質(zhì)、病原體和生物分子，也可用于對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記等［11］，在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選、生物大分子相互作用等研究中有極大的應(yīng)用前景［12］。

Suzuki 等［10］用QD 和抗體開(kāi)發(fā)了一種量子點(diǎn)連接免疫吸附法（QLISA），并基于這種方法建立了一種微量IL-6的檢測(cè)方法，可用于0.05 ng/mL 級(jí)別IL-6的檢測(cè)。Zhou等［13］對(duì)一種基于QD的高靈敏度肌鈣蛋白的檢測(cè)方法進(jìn)行了評(píng)估，該方法將1～2 h 的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)縮短至12 min，且使用全血標(biāo)本，保證了對(duì)急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）較高的診斷效率，更適用于POCT的檢測(cè)和快速診斷。

1.3 AuNP

AuNP 作為人類(lèi)最早認(rèn)識(shí)并應(yīng)用的納米材料之一，在整個(gè)納米材料研究領(lǐng)域中占據(jù)著重要地位。AuNP具有易于表面修飾、較高的生物相容性、獨(dú)特的光學(xué)特性等特點(diǎn)［14］，應(yīng)用于諸多體外診斷的檢測(cè)體系中，如在生物條形碼技術(shù)（bio-barcode assay，BCA）中，利用AuNP 比表面積大、易于表面修飾等特性，在AuNP上修飾了大量單鏈DNA，這是實(shí)現(xiàn)該技術(shù)“信號(hào)擴(kuò)增”的關(guān)鍵［15-16］；借助AuNP的納米材料表面能量轉(zhuǎn)移（nanometal surface energy transfer，NSET）特性，Yuan等［17］構(gòu)建了一種能對(duì)尿液標(biāo)本中精胺進(jìn)行痕量檢測(cè)的方法，證明了其能成為有機(jī)染料猝滅劑的替代品，可以為各種生物分析物構(gòu)建可激活探針；此外，也有研究者發(fā)現(xiàn)，在PCR反應(yīng)體系中加入適量的AuNP，可減少引物和單鏈DNA 模板之間的錯(cuò)配，提高PCR反應(yīng)的特異性［18］。

2 納米材料在蛋白質(zhì)檢測(cè)分析中的應(yīng)用

2.1 鄰位連接技術(shù)

鄰位連接技術(shù)（proximity ligation assay，PLA）是一種將蛋白定量檢測(cè)轉(zhuǎn)化為核酸定量檢測(cè)的技術(shù)，是用于檢測(cè)目標(biāo)蛋白或蛋白之間相互作用的特殊免疫分析方法。在PLA技術(shù)中，一對(duì)可識(shí)別目標(biāo)蛋白不同抗原表位的抗體通過(guò)共價(jià)交聯(lián)或者生物素-親和素分別與一條寡核苷酸探針（單鏈DNA）相連。這對(duì)抗體結(jié)合在目標(biāo)蛋白的相鄰表位后，加入一段可分別與前述兩個(gè)探針互補(bǔ)的寡聚脫氧核苷酸（connector oligonucleotides），在連接酶的作用下，3段單鏈DNA形成的雜交分子被連接形成一條新的DNA片段，隨即通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行定量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定量檢測(cè)［19］。2007年，Schallmeiner 等［20］報(bào)道了一種3PLA 技術(shù)，提升了敏感性和檢測(cè)范圍；之后在2013 年，Nong 等［21］介紹了一種具有高特異性、樣本量變化范圍廣（從幾微升到幾毫升）的固相PLA技術(shù)?；诩{米材料的鄰位連接技術(shù)（nanoparticle-based proximity ligation assay，NP-PLA）是由Chen等［22］在PLA及其衍生技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的超靈敏檢測(cè)技術(shù)。Chen等［22］在PLA中引入納米粒子，不再將核酸探針與抗體耦聯(lián)，而是將納米粒子耦聯(lián)在抗體上后，將生物素化的核酸探針結(jié)合在納米粒子表面空余的親和素位點(diǎn)上，由此，NP-PLA 兼具了3PLA 和固相PLA 的優(yōu)點(diǎn)。隨后，Chen 等［22］使用這一技術(shù)完成了對(duì)人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）的檢測(cè)和定量，其檢測(cè)限低至2.6 fmol/L，幾乎是ELISA 技術(shù)的1 000倍。

2.2 AuNP作標(biāo)記物的蛋白檢測(cè)技術(shù)

AuNP 是一種無(wú)毒、易于表面修飾、具有較高生物相容性和獨(dú)特光學(xué)特性的納米材料［14］。AuNP 由于其局部表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）、表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhancement of Raman scattering，SERS）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（F?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）等獨(dú)特的物理和光學(xué)性質(zhì)被應(yīng)用于諸多領(lǐng)域［23］。在此討論AuNP在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。

金納米簇（gold nanoclusters，AuNC）是一種小于2 nm 的新型熒光材料，由2～100 個(gè)金原子組成。根據(jù)組成和大小的不同，AuNC 的發(fā)射光譜可在紫外區(qū)到近紅外區(qū)改變，利用AuNC的這一特性，可選擇背景干擾小的波長(zhǎng)［23］。由于AuNC 易于聚集，因此適當(dāng)?shù)呐潴w對(duì)于穩(wěn)定其熒光和大小必不可少，常用的配體有牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等［24-25］。將AuNC 作為熒光基團(tuán)，選用某種特定的物質(zhì)作為淬滅基團(tuán)，通過(guò)FERT 淬滅其熒光；當(dāng)兩者形成的這一體系遇到目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，AuNC 與淬滅基團(tuán)分離，淬滅作用消失而使熒光恢復(fù)，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)（圖1）［24-27］。根據(jù)AuNC 的這種性質(zhì)，Xu 等［24］設(shè)計(jì)并制備了一種基于AuNC 和AuNP 的新型熒光探針，用于尿液L-半胱氨酸的檢測(cè)。Menon 等［25］使用BSA-AuNC 標(biāo)記胰島素抗體，構(gòu)建了一種檢出限為1.1×10-10g/mL 的胰島素檢測(cè)方法。

圖1 基于AuNC的檢測(cè)技術(shù)模式圖Figure 1 Basic principles of protein detection using AuNC

NSET 是一種類(lèi)似于FRET 的現(xiàn)象。AuNP 已被證明是一種高效的能量受體，當(dāng)AuNP 和熒光基團(tuán)接近到一定范圍時(shí)，熒光基團(tuán)的能量即轉(zhuǎn)移至AuNP 表面，發(fā)生熒光淬滅。兩者不同之處在于FRET 有著嚴(yán)格的距離（100?，1?=10-10m）和方向限制，而NSET的偶極-納米表面?zhèn)鬟f距離可以在更長(zhǎng)的距離上具有更高的淬滅效率，因此，AuNP有機(jī)會(huì)成為有機(jī)染料猝滅劑的替代品，為各種生物分析物構(gòu)建可激活的探針［17，23］。Yuan等［17］利用金納米棒、四羧基苯基卟啉和小牛胸腺DNA（ctDNA）的相互作用開(kāi)發(fā)了一種基于NSET的惡性腫瘤生物標(biāo)志物精胺的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿液標(biāo)本中精胺的痕量檢測(cè)［17］。

在科學(xué)研究和許多疾病的早期診斷和治療中，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)超低水平的蛋白質(zhì)標(biāo)志物至關(guān)重要。在這些方法中，NP-PLA 和BCA［15］（在后文中詳細(xì)介紹）將不可擴(kuò)增的蛋白質(zhì)檢測(cè)轉(zhuǎn)化為核酸檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)。根據(jù)反應(yīng)體系中所用的抗體不同，NP-PLA 和BCA 的檢測(cè)對(duì)象非常廣泛，但同時(shí)意味著其特異性受所用抗體特異性的影響；AuNP 作標(biāo)記物的蛋白檢測(cè)技術(shù)，利用AuNP 的FERT或NSET特性，構(gòu)建了類(lèi)似于實(shí)時(shí)熒光PCR中熒光探針的熒光信號(hào)系統(tǒng)，并以一定線性范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度的增量［24-25］或減量［17］反映物質(zhì)間的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)了超低水平的蛋白質(zhì)檢測(cè)。

3 納米材料在核酸檢測(cè)分析中的應(yīng)用

3.1 納米層析技術(shù)

納米層析試紙條是一類(lèi)基于橫向流動(dòng)檢測(cè)（lateral flow assay，LFA）可用于對(duì)PCR 擴(kuò)增［28-29］、雜交鏈反應(yīng)（hybridization chain reaction，HCR）［30］、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［31］等擴(kuò)增獲得的核酸產(chǎn)物進(jìn)行快速驗(yàn)證的裝置。相比傳統(tǒng)的電泳、成像等方法，使用基于納米層析試紙條的納米層析技術(shù)對(duì)核酸產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證不需要昂貴的儀器，操作簡(jiǎn)便，且具有耗時(shí)短、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合在設(shè)備條件有限的地區(qū)應(yīng)用，同時(shí)也可以滿足POCT的需求［31-32］。

Ying 等［30］使用納米層析試紙條檢測(cè)通過(guò)雜交鏈反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合體，開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)沙門(mén)菌屬16S rRNA 的可視化檢測(cè)方法（圖2），其檢測(cè)限為3×103CFU/mL。

圖2 納米層析試紙條［30］Figure 2 lateral flow nucleic acid test strips［30］

3.2 納米材料輔助PCR技術(shù)

自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR 技術(shù)）出現(xiàn)以來(lái)，人類(lèi)對(duì)DNA 和RNA 的檢測(cè)和分析能力不斷進(jìn)步，現(xiàn)已成為診斷疾病的一項(xiàng)重要手段。PCR 技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)和體外診斷領(lǐng)域中最基本且最受歡迎的技術(shù)之一，可將極微量的DNA 擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，使其達(dá)到可檢測(cè)的水平，被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。自該技術(shù)誕生以來(lái)，大量研究人員從試劑、儀器和PCR 程序?qū)用鎸?duì)其進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，大大提高了擴(kuò)增效率，并逐漸發(fā)展出巢式PCR、多重PCR、RT-PCR、熒光定量PCR、數(shù)字PCR 等適用于不同目的、高靈敏度的方法［33］。但與敏感性的提高相比，PCR 技術(shù)的特異性仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，并在對(duì)富含GC片段、DNA長(zhǎng)片段擴(kuò)增分析中存在一定問(wèn)題［18］，盡管人們發(fā)現(xiàn)在PCR體系中加入如二甲基亞砜［34］、BSA［34］、單鏈結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）［35］等作為增強(qiáng)劑（enhencer）可促進(jìn)PCR 擴(kuò)增，但總體效果仍不甚理想。

隨著納米技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的逐步滲透，納米材料輔助PCR（nanoPCR）技術(shù)受到了廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，納米粒子在PCR反應(yīng)體系中的作用主要體現(xiàn)在3個(gè)方面。①與DNA 分子結(jié)合：納米粒子（如AuNP、碳納米管等）可與單鏈DNA結(jié)合，從而減少引物和單鏈DNA模板之間的錯(cuò)配。此外，一些納米粒子也可以促進(jìn)PCR 反應(yīng)過(guò)程中DNA 模板的雙鏈解離，降低解鏈溫度［18，36-37］。②與DNA 聚合酶相互作用：一些納米粒子可增強(qiáng)DNA 聚合酶的活性，但過(guò)高濃度的納米粒子會(huì)對(duì)DNA聚合酶產(chǎn)生抑制作用，這種抑制作用在一定程度上可以通過(guò)增加DNA聚合酶使用量來(lái)抵消［18，37］。③納米粒子具有優(yōu)良的熱傳導(dǎo)性，可使PCR反應(yīng)體系更快地達(dá)到設(shè)定溫度，提高擴(kuò)增效率，并使引物和模板之間更高效地配對(duì)［18，36］。

有研究報(bào)道了一種對(duì)食腦阿米巴原蟲(chóng)的NanoPCR 檢測(cè)方法，他們將石墨烯氧化物、氧化銅和氧化鋁3種納米材料加入普通PCR體系中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)幾種阿米巴的快速診斷，且核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶灰度值為不加納米粒子對(duì)照組的1.25～2倍，可見(jiàn)其擴(kuò)增產(chǎn)率增加［36］。Yang 等［37］在PCR 體系中加入不同濃度的AuNP，分別使用Pfu聚合酶和Taq聚合酶成功擴(kuò)增了富含鳥(niǎo)嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的片段，為基因組中富GC片段的擴(kuò)增提供了一種可行的方法。

3.3 納米孔測(cè)序技術(shù)

上世紀(jì)70年代中期，以雙脫氧鏈終止法（Sanger法）［39］為代表的第1 代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)開(kāi)啟了人類(lèi)對(duì)基因組探索的歷程。1990—2003 年的人類(lèi)基因組計(jì)劃（human genome project，HGP）直接推動(dòng)了測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，此后，測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅猛，第2代、第3代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

納米孔是一種納米大小的孔，由生物分子自組裝或在固體基質(zhì)上進(jìn)行物理鉆孔形成，可分為生物納米孔、固態(tài)納米孔以及由兩者結(jié)合而成的復(fù)合納米孔3類(lèi)。納米孔測(cè)序的基本原理是將電流應(yīng)用于納米級(jí)的分子孔，然后使遺傳物質(zhì)從中通過(guò)，由于構(gòu)成遺傳物質(zhì)的堿基的分子結(jié)構(gòu)和體積存在差異，不同堿基穿過(guò)納米孔時(shí)引起不同的電流變化，由此即可得出所測(cè)DNA 或RNA 的序列信息（圖3）［40-41］。作為一種高通量、高讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)輸出［42］的單分子測(cè)序技術(shù)，納米孔測(cè)序技術(shù)被認(rèn)為是第3 代測(cè)序技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展方向。此外，納米孔測(cè)序技術(shù)還因具有無(wú)需各種酶的參與、無(wú)需生物分子修飾標(biāo)記或表面固定化技術(shù)、低成本等優(yōu)勢(shì)［40］，而在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）的“1 000美元基因組計(jì)劃”中脫穎而出。目前，由牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technology，ONT）開(kāi)發(fā)的幾代產(chǎn)品已開(kāi)始應(yīng)用于體外診斷和公共衛(wèi)生等領(lǐng)域。

圖3 納米孔測(cè)序Figure 3 Nanopore sequencing

此前，納米孔測(cè)序技術(shù)因?yàn)殄e(cuò)誤率相對(duì)較高、需要多次處理消除測(cè)序錯(cuò)誤等問(wèn)題而影響了其對(duì)于第2 代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing technology，NGS）的競(jìng)爭(zhēng)力［41，43-44］，但隨著該測(cè)序技術(shù)的成熟完善帶來(lái)的測(cè)序準(zhǔn)確率的提高，其高通量、高讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)輸出以及可以進(jìn)行直接RNA測(cè)序的優(yōu)勢(shì)逐漸得以體現(xiàn)。ORSINI 等［45］開(kāi)發(fā)了一種基于納米孔測(cè)序的快速檢測(cè)BCR-ABL1 融合基因的方法，這對(duì)急性白血病等急需得出診斷結(jié)果的疾病診斷有極大意義。使用納米孔測(cè)序技術(shù)以原生RNA形式對(duì)流感病毒基因組進(jìn)行直接測(cè)序，顛覆了以往先用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA 后測(cè)序的流程，避免了CG偏倚，同時(shí)保留了基因組中的堿基修飾信息，在相關(guān)領(lǐng)域研究中具有重大價(jià)值［41］。除此以外也有利用納米孔測(cè)序技術(shù)在西非疫區(qū)實(shí)驗(yàn)室對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行測(cè)序［46］和在7～12.5 h內(nèi)得到結(jié)核分枝桿菌鑒定全基因組測(cè)序的結(jié)果，并借此得出種屬鑒定和耐藥性推測(cè)的報(bào)道［47］。在新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）大流行期間，納米孔測(cè)序方法在病毒基因組測(cè)序［48］、進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和完善檢測(cè)技術(shù)以應(yīng)對(duì)病毒變異［49-50］的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

目前，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是核酸檢測(cè)技術(shù)中的主流方法，具有極高的普及率。因此，在評(píng)價(jià)核酸檢測(cè)技術(shù)時(shí)，往往需要以該技術(shù)為參照。在上述核酸檢測(cè)技術(shù)中，納米層析技術(shù)作為一種單純的核酸產(chǎn)物的檢測(cè)手段，實(shí)驗(yàn)步驟必然會(huì)多于集擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)于一體的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，因此應(yīng)選擇諸如LAMP 等設(shè)備要求不高的核酸擴(kuò)增方法，開(kāi)發(fā)適用于現(xiàn)場(chǎng)的即時(shí)檢驗(yàn)方法；PCR 方法普遍具有升降溫過(guò)程長(zhǎng)、耗時(shí)、具有一定假陰性率的缺點(diǎn)，在體系中加入納米粒子后擴(kuò)增效率和敏感性得到提升；納米孔測(cè)序技術(shù)作為一種高通量、高讀長(zhǎng)的測(cè)序技術(shù)，已在多個(gè)研究和應(yīng)用領(lǐng)域中發(fā)揮作用，是核酸檢測(cè)技術(shù)的強(qiáng)力補(bǔ)充。

4 納米材料在體外檢測(cè)領(lǐng)域中的其他應(yīng)用

4.1 納米生物傳感器

生物傳感器是將生物活性材料與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)導(dǎo)元件組合在一起用來(lái)選擇性并且可逆性地檢測(cè)各種類(lèi)型樣品中的生物化學(xué)物質(zhì)濃度或活性的裝置［51］，主要由識(shí)別元件和理化轉(zhuǎn)換器構(gòu)成。生物傳感器常可分為光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器和壓電傳感器，具有響應(yīng)迅速、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)和多重檢測(cè)、使用便捷、檢測(cè)成本低、體積小等優(yōu)點(diǎn)［52］，對(duì)海關(guān)和傳染病暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的疾病防控以及相對(duì)落后國(guó)家或地區(qū)的疾病診斷具有重要意義。納米生物傳感器是將納米材料（如金納米簇［17］、金納米線［53］、碳量子點(diǎn)［54］等）與生物傳感器結(jié)合制成的復(fù)雜儀器，綜合應(yīng)用光、電、聲、色等各種先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、酶活性、微生物等［53-56］乃至重金屬離子等環(huán)境有毒物質(zhì)［57］進(jìn)行檢測(cè)的復(fù)雜儀器，對(duì)臨床檢測(cè)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、國(guó)家安全等多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生影響。Aghili 等［53］研發(fā)了一種用于檢測(cè)血清中帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）生物標(biāo)志物miR-195 的DNA 雜交電化學(xué)納米生物傳感器（圖4），使用納米材料增加電極的有效表面積，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，可用于PD的早期診斷。Srivastava等［58］報(bào)道了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的納米生物傳感器，用于大腸埃希菌的檢測(cè)，具有高度特異性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有較低的檢測(cè)限（1.5×102CFU/mL，可達(dá)單個(gè)細(xì)菌的濃度水平）。

4.2 BCA技術(shù)

圖4 基于DNA雜交的電化學(xué)納米生物傳感器［53］Figure 4 Electrochemical nanobiosensor based on DNA hybridization［53］

BCA 技術(shù)是本世紀(jì)初出現(xiàn)的一項(xiàng)以“信號(hào)放大”為基礎(chǔ)的新型分子診斷技術(shù)。該技術(shù)的檢測(cè)體系中包含AuNP和MNP兩種納米粒子，其中，表面帶有單克隆抗體（或單鏈DNA）的MNP 主要用于被檢測(cè)物質(zhì)的分離，表面帶有多克隆抗體（或單鏈DNA）及大量“條碼DNA”的AuNP 用于捕獲被檢測(cè)物質(zhì)。當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，兩種納米顆粒與被目標(biāo)物質(zhì)形成“AuNP-目標(biāo)物-MNP”三明治結(jié)構(gòu)（圖5）。利用磁場(chǎng)分離這一“三明治”結(jié)構(gòu)后，使用一定方法釋放生物條形碼DNA，并進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。2003年首次報(bào)道用該技術(shù)成功進(jìn)行了前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）的檢測(cè)，由于AuNP 表面結(jié)合有大量的生物條形碼DNA，可將檢測(cè)靈敏度提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)；Thaxton 等［59］使用BCA技術(shù)成功對(duì)前列腺癌根治性前列腺切除術(shù)后的男性血清中常規(guī)方法無(wú)法檢出的低濃度PSA 進(jìn)行了檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)前列腺癌復(fù)發(fā)狀況的預(yù)測(cè)；Yin 等［60］也使用BCA技術(shù)對(duì)藍(lán)舌病毒外核蛋白VP7進(jìn)行了特異性檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.1 fg/mL。其巧妙之處在于將無(wú)法擴(kuò)增的蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)化為有多種擴(kuò)增和檢測(cè)手段的核酸檢測(cè)，從而為蛋白質(zhì)檢測(cè)提供了新思路。

圖5 BCA在蛋白質(zhì)檢測(cè)［15］和DNA檢測(cè)［16］中所形成的三明治結(jié)構(gòu)Figure 5 Sandwich structures formed in protein［15］and DNA［16］detection using BCA

除在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用外，BCA 技術(shù)還在2007 年被報(bào)道用于枯草芽孢桿菌雙鏈DNA 的檢測(cè)［16］；Aminia等［61］用針對(duì)銅綠假單胞菌外毒素A基因的兩種核酸探針、AuNP 和MNP，構(gòu)建了外毒素A基因片段的檢測(cè)體系。用磁場(chǎng)分離出“AuNP-目標(biāo)核酸分子-MNP”的三明治結(jié)構(gòu)后，他們用二硫蘇糖醇溶液釋放結(jié)合在AuNP 上的DNA 條形碼并用熒光分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限低至1.2 ng/mL，且具有檢測(cè)速度快、選擇性好、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。此外，BCA 技術(shù)也衍生出一些變體。Lin 等［62］開(kāi)發(fā)了一種基于納米酶的生物條碼熒光檢測(cè)技術(shù)，他們利用鉑-金納米粒（Pt-AuNP）的過(guò)氧化物酶活性催化amplex red（AR）產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)艾滋病病毒和乙肝病毒DNA 的同時(shí)檢測(cè)。此類(lèi)方法相比基于PCR 的核酸檢測(cè)技術(shù)更適用于POCT。

5 小結(jié)和展望

納米科學(xué)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的新興學(xué)科，與信息科學(xué)、生命科學(xué)并列為21 世紀(jì)最有前途的三大新技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域，其應(yīng)用已涉及醫(yī)療衛(wèi)生、感染防控、食品工程、廢水處理等大量領(lǐng)域。目前，在臨床體外診斷檢測(cè)領(lǐng)域，特性各異的納米材料已成為研究者們優(yōu)化現(xiàn)有方法、開(kāi)發(fā)新檢測(cè)技術(shù)的重要元件?；诩{米材料的檢測(cè)方法對(duì)相關(guān)標(biāo)志物（PSA、HCG等）檢測(cè)中表現(xiàn)出的高特異性、低檢測(cè)限（表1），使其在某些疾病，特別是前列腺癌等惡性腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估中具有較大的應(yīng)用價(jià)值［22，59］。在病原體檢測(cè)方面，將納米材料加入PCR反應(yīng)體系后，可提高PCR反應(yīng)的靈敏性和特異性［38］；在臨床上遇到難以分離鑒定的病原體時(shí)，可將測(cè)序技術(shù)作為最后手段使用，但目前常用的二代測(cè)序技術(shù)的速度、成本等因素還不能完全滿足臨床感染快速診斷的需求，而納米孔測(cè)序雖然仍在不斷改進(jìn)完善中，卻因其低成本、使用簡(jiǎn)單、高讀長(zhǎng)、設(shè)備和環(huán)境要求低等特性，在病原體鑒定、白血病等基因突變引起的急性病快速診斷中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［45，47］。在熒光檢測(cè)中，以QD為主的納米材料具有抗光漂白性強(qiáng)、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等特點(diǎn)，且可通過(guò)調(diào)整粒徑大小改變發(fā)射光波長(zhǎng)避開(kāi)易受到干擾的波段，從而使得整個(gè)檢測(cè)體系更具抗干擾性。得益于QD 的這一特性，開(kāi)發(fā)者和臨床工作者們可以在實(shí)際應(yīng)用中嘗試使用全血標(biāo)本代替血清，簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，使之更加適合POCT，且縮短了檢驗(yàn)周期［13，63］，更好地符合臨床需要。由此可預(yù)見(jiàn)，納米技術(shù)與臨床檢驗(yàn)診斷的結(jié)合終將給體外診斷技術(shù)和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)行業(yè)帶來(lái)一場(chǎng)變革。

表1 各種基于納米材料的體外診斷技術(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of in-vitro diagnostics based nanomaterials

值得注意的是，基于納米材料的檢驗(yàn)方法常常需要對(duì)納米材料進(jìn)行表征，開(kāi)發(fā)可重復(fù)程序，以保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性［64］，這在臨床實(shí)踐中可行性較低。因此，大部分納米檢測(cè)技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用仍需依賴體外診斷企業(yè)的投入和納米技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；同時(shí)，盡管該類(lèi)技術(shù)有眾多優(yōu)勢(shì)，但在進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，還需要一定人力物力的投入，培養(yǎng)相應(yīng)的技術(shù)人員，這也使得基于納米材料的檢驗(yàn)技術(shù)距離臨床大規(guī)模應(yīng)用尚有距離。而在生產(chǎn)、使用、廢棄過(guò)程中進(jìn)入環(huán)境的納米材料，可造成一定的生態(tài)效應(yīng)和人群暴露。根據(jù)國(guó)內(nèi)外納米毒理學(xué)的研究，納米材料可以通過(guò)引起人體氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞自噬、在生理環(huán)境中吸附一系列蛋白質(zhì)形成“蛋白冠”等方式，對(duì)細(xì)胞和機(jī)體產(chǎn)生毒性作用［65-66］。因此，在應(yīng)用納米材料的同時(shí)，也應(yīng)加快制定完善的納米技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，避免走上“先污染后治理”的老路。

總之，基于納米材料的體外診斷技術(shù)由于靈敏度高、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，具有臨床應(yīng)用的巨大潛力。與此同時(shí)，由于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)仍能應(yīng)對(duì)日常工作中的大部分需求，以及納米檢驗(yàn)技術(shù)本身存在的商品化程度不足、產(chǎn)業(yè)鏈不成熟、自身技術(shù)不完善、需要相應(yīng)技術(shù)人員等原因，該類(lèi)技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用仍面臨一定阻礙?？梢灶A(yù)見(jiàn)的是，隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)和納米科學(xué)的發(fā)展，以及體外診斷公司和區(qū)域檢驗(yàn)中心的興起，未來(lái)這類(lèi)技術(shù)將不斷進(jìn)入臨床應(yīng)用，并揚(yáng)長(zhǎng)避短地滿足不同臨床需要，更好地服務(wù)臨床醫(yī)學(xué)乃至全人類(lèi)。