王鳳英，王 亭，李曉忠，林 強(qiáng)

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院兒科，江蘇 南京 211100；2蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎臟免疫科，江蘇 蘇州 215000

小兒血管炎是一組復(fù)雜性的疾病，過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP）是我國和西方國家兒童最常見的血管炎，國際上已建議將其更名為IgA血管炎；HSP的病理特點(diǎn)是小血管炎癥伴有IgA1沉積物，補(bǔ)體因子和大量中性粒細(xì)胞浸潤，伴有腎炎的HSP類似于IgA腎?。?-2］，但其確切病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全清楚。

髓樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體（triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM）家族是一類新發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族的成員，目前TREM 家族包含TREM1、TREM2、TREM3、TREM4、TREM 樣轉(zhuǎn)錄因子1（TREM like transcript 1，TLT1）、TLT2、TLT3、TLT4、TLT5、TLT6 等多個受體成員，這些受體在各種髓系細(xì)胞上表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、炎癥和某些細(xì)胞功能方面均發(fā)揮重要作用［3-5］。TREM1和TLT1均主要以膜表面分子和可溶性分子兩種表達(dá)形式存在?？扇苄运铇蛹?xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體1（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 1，sTREM1）和可溶性髓樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體樣轉(zhuǎn)錄物1（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-like transcript 1，sTLT1）在成人風(fēng)濕病中已有研究，但在兒童風(fēng)濕性疾病中研究較少，尤其在兒童HSP 中鮮有研究，故本研究探討sTREM1和sTLT1在兒童HSP中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象

選取2016 年4 月—2018 年5 月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院及門診治療的HSP 患兒102 例，男57 例，女45 例，年齡（6.88±2.25）歲，其中皮膚型20 例，關(guān)節(jié)型23 例，腹型17 例，混合型19 例，腎型23 例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2006 年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟和歐洲兒科風(fēng)濕病學(xué)會制定的兒童血管炎新的分類標(biāo)準(zhǔn)［6］；部分患兒僅表現(xiàn)為單純皮疹而無其他癥狀，則根據(jù)2012 年長沙兒童HSP 診治專家座談會的建議［7］。HSP患兒均為初次發(fā)病，病程在3 d內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外患有先天性畸形、惡性腫瘤、近期糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物使用等情況的HSP 患兒。根據(jù)臨床表現(xiàn)將HSP 分為5 型。皮膚型：只有皮膚癥狀；關(guān)節(jié)型：除皮膚紫癜外，有關(guān)節(jié)受累；腹型：除皮膚紫癜外，有消化道受累；混合型：同時有皮膚、消化道和關(guān)節(jié)受累（本型不包括腎受累者）；腎型：有皮膚紫癜和腎受累，伴或不伴消化道或/和關(guān)節(jié)受累。其中腎型診斷符合2009 年中華醫(yī)學(xué)會兒科分會腎臟病學(xué)組制定的兒童紫癜性腎炎診治循證指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。正常對照組兒童50例，男33例，女17例，年齡（6.26±2.13）歲，兩組兒童的年齡（t=1.54，P=0.126）、性別（χ2=1.42，P=0.233）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

采集各組兒童空腹靜脈血3 mL，置血清分離膠管，2 000 r/min離心5 min分離血清并分裝于EP管，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清sTREM1和sTLT1的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清sTREM1 和sTLT1 的水平，按照儀器操作規(guī)程和試劑盒說明書要求進(jìn)行，sTREM1 檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，sTLT1 檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程公司。各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值減去空白孔平均吸光度值后作圖，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為橫坐標(biāo)，用ELISA Calc-回歸/擬合v0.2 軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出每個樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析后采用LSD 進(jìn)行兩兩比較。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法。采用Pearson 或Spearman相關(guān)分析sTLT1 與其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在多組間率的兩兩比較時，因要比較的組別有5組，要進(jìn)行10次比較，故采用Bonferroni 法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，將α=0.05 調(diào)整為α’=0.005。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清sTREM1檢出率及比較

HSP患兒和對照兒童sTREM1的檢出例數(shù)和陽性率分別為：79例（77.45%），10例（20.00%）；HSP兒童血清sTREM1 檢出率高于對照兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=45.63，P＜0.001）。

2.2 兩組兒童血清sTLT1水平及比較

HSP 患兒和對照兒童的sTLT1 水平分別為（98.57±24.72）ng/mL 和（62.84±22.74）ng/mL；HSP 患兒血清sTLT1 水平高于對照兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.58，P＜0.001）。

2.3 不同臨床類型HSP 患兒血清sTREM1 檢出率及比較

不同臨床類型HSP患兒血清sTREM1檢出例數(shù)和檢出率如下：皮膚型12/20 例（60.00%），關(guān)節(jié)型18/23 例（78.26%），腹型13/17 例（76.47%），混合型13/19 例（68.42%），腎型23/23（100.00%）。組間比較并經(jīng)Bonferroni 法校正，按a’=0.005 水準(zhǔn)，腎型HSP 患兒sTREM1 的檢出率高于皮膚組（P＜0.005），其余各組檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.005，表1）。

表1 不同臨床類型HSP患兒血清sTREM1檢測結(jié)果比較

2.4 不同臨床類型HSP 患兒血清sTLT1 檢測水平及比較

不同臨床類型HSP患兒血清sTLT1檢測結(jié)果見表2，組間比較顯示關(guān)節(jié)型、腹型及混合型的水平高于皮膚型（P＜0.05），其余各組檢測水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.5 HSP患兒sTLT1與其他檢查指標(biāo)的相關(guān)性

將sTLT1 與白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、C 反應(yīng)蛋白、D-D 二聚體、IgG、IgA、IgM、C3、C4、淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD19+CD23+、CD3-CD（16+56+）進(jìn)行相關(guān)性分析，sTLT1 與血小板呈正相關(guān)性（r=0.389，P＜0.001），sTLT1 與上述其他指標(biāo)均無相關(guān)性（P均＞0.05）。

表2 不同臨床類型HSP患兒血清sTLT1檢測結(jié)果及比較

2.6 sTREM1檢出與未檢出患兒sTLT1及其他實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較

將79 例sTREM1 檢出患兒（稱為sTREM1 陽性組）和23 例未檢出患兒（稱為sTREM1 陰性組）的sTLT1及其他實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)進(jìn)行比較，sTREM1陽性組的IgA、白細(xì)胞、血小板高于sTREM1陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，表3）。

表3 sTREM1檢出與未檢出患兒sTLT1及其他檢查指標(biāo)比較

3 討論

TREM1 已在中性粒細(xì)胞、成熟單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中被鑒定出，能加強(qiáng)炎癥反應(yīng)、正向調(diào)控自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明TREM1可望成為治療炎癥性和腫瘤性疾病的新靶點(diǎn)［9-10］。sTREM1 可抑制配體與細(xì)胞膜上TREM1 的結(jié)合，阻止炎癥反應(yīng)信號的傳導(dǎo)，在免疫應(yīng)答平衡中起重要作用［11］。sTREM1致病作用已經(jīng)在多種自身免疫疾病中得到證實(shí)，提示TREM1在自身免疫疾病中起重要作用。sTREM1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、白塞病、彌漫性系統(tǒng)性硬化癥和結(jié)節(jié)病患者中表達(dá)增加；sTREM1也被證明在炎癥性腸病患者的腸道中上調(diào)，血清sTREM1可能是中國炎癥性腸病患者疾病活動性監(jiān)測的一個潛在血清生物標(biāo)志物［12-15］。血漿sTREM1在抗磷脂抗體綜合征中明顯增高，尤其是血栓事件患者，提示血漿sTREM1水平升高與炎癥活動有關(guān)，可望成為血栓形成的生物標(biāo)志物［15］。本研究中，HSP患兒sTREM1 的陽性率明顯高于正常兒童，且sTREM1 陽性組患兒IgA、白細(xì)胞、血小板高于sTREM1 陰性組患兒，結(jié)合HSP 的免疫病理發(fā)病機(jī)制，本研究表明sTREM1 陽性患兒小血管炎癥損害較陰性患兒重，且血液呈高凝狀態(tài)，提示sTREM1 可作為HSP患兒病情嚴(yán)重性的標(biāo)志物。本研究中，臨床類型不同的HSP患兒血清sTREM1的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明腎型HSP 患兒sTREM1 的檢出率高于皮膚組，其余各亞組檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，鑒于臨床分型后各亞組病例數(shù)相對較少，故sTREM1 增高與HSP腎臟損害是否有關(guān)聯(lián)尚需擴(kuò)大樣本數(shù)進(jìn)一步研究。雖然多篇報(bào)道指出TREM1為促炎介質(zhì)，但有證據(jù)顯示這種受體的復(fù)雜性和雙重作用［16］，且已表明TREM1 過度刺激也可能是保護(hù)性抗炎反應(yīng)所必需的，TREM1缺失會加重肝膿腫及狼瘡的疾病活動［17-18］，故sTREM1 在HSP 中起促炎或抑炎作用尚需要深入研究探討。

血小板在止血、血栓形成、炎癥、傷口愈合和宿主防御等生理過程中發(fā)揮重要作用，TLT1存在于血小板和巨核細(xì)胞的α-顆粒中，活化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，其表達(dá)水平在機(jī)體發(fā)生炎癥時會顯著增加，除調(diào)節(jié)血小板功能外，其他潛在靶標(biāo)是白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［4，19-20］，可調(diào)節(jié)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的相互作用［21-22］。sTLT1 促進(jìn)血小板內(nèi)皮細(xì)胞相互作用、促進(jìn)肌動蛋白聚合和血小板聚集、調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化［23-24］。多數(shù)研究表明sTLT1 起著TREM 家族抑制劑的作用，sTLT1可通過影響TREM1來調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化，并且該分子起到炎癥級聯(lián)反應(yīng)抑制劑的作用，維護(hù)體內(nèi)平衡并防止組織損傷［23，25］。但在冠狀動脈粥樣硬化心臟病中的一項(xiàng)研究顯示，sTLT1 與Fc?RI結(jié)合后通過誘導(dǎo)SYK/MEK/ERK信號級聯(lián)反應(yīng)而活化NF-κB，誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，加重炎癥［24］。上述各研究結(jié)果不一致的原因，可能是sTLT1 在不同的組織器官或疾病中，具有特異性的病理生理作用機(jī)制。

本研究中HSP 患兒sTLT1 水平較正常兒童增高，結(jié)合關(guān)節(jié)型、腹型及混合型的sTLT1水平高于皮膚型，表明sTLT1水平增高患兒炎癥反應(yīng)重、易引起皮膚外的臟器受累，提示sTLT1 可作為兒童HSP 的炎癥指標(biāo)。腎型HSP患兒的sTLT1平均水平雖有增高趨勢，但未顯示與皮膚型的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析可能原因?yàn)閮和疕SP累及腎臟的發(fā)病機(jī)制及sTLT1在其發(fā)病中的作用均有別于HSP 累及其他臟器。sTLT1 增加血小板黏附和肌動蛋白聚合，可導(dǎo)致血小板聚集增加、與內(nèi)皮細(xì)胞接觸增多［21］，本研究HSP患兒sTLT1 水平增高且與血小板呈正相關(guān)，HSP 患兒多同時伴有血小板升高，且本課題組前期研究顯示D-D 二聚體在HSP 患兒中亦明顯增高［26］，故HSP患兒sTLT1 與血小板、D-D 二聚體同時增高使受累臟器更易出現(xiàn)局部凝血和微血栓形成。一項(xiàng)研究表明膿毒癥患者的血漿sTLT1 水平明顯增高，且sTLT1水平與彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）的相關(guān)性強(qiáng)于D-D 二聚體，表明sTLT1 可作為膿毒癥監(jiān)測DIC 發(fā)生的新的候選生物標(biāo)志物［18］。本研究在sTLT1與其他指標(biāo)的相關(guān)性研究中，sTLT1除與血小板呈正相關(guān)外，未發(fā)現(xiàn)與D-D二聚體、血常規(guī)其他指標(biāo)、免疫球蛋白及補(bǔ)體等的相關(guān)性，故sTLT1能否作為HSP患兒血液高凝狀態(tài)的標(biāo)志物尚需進(jìn)一步研究探討。

雖然sTREM1 的來源和功能仍然未完全闡明，但在感染和非感染性炎癥疾病中，其作為生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的可能性很大。應(yīng)用小分子和肽抑制TREM1受體活化是研發(fā)治療藥物的策略，抑制性肽可作為清除劑受體結(jié)合TREM1 配體，從而阻止TREM1 活化。sTREM1 是開發(fā)抑制性肽的方案之一，其中由TLT1 衍生的肽LR12（LQEEDAGEYGCM）代表TLT1 的保守基序，是一類有前途的化合物，可用于抑制多種非感染及感染性疾病中的有害炎癥［27］，該肽在雙盲、隨機(jī)、安慰劑對照的I期臨床試驗(yàn)中顯示人體耐受性良好，且無不良反應(yīng)。本研究提示sTREM1 和sTLT1 參與了兒童HSP的發(fā)病，可作為兒童HSP炎癥程度和病情嚴(yán)重度的標(biāo)志物，為該類藥物應(yīng)用于兒童風(fēng)濕免疫性炎癥的治療提供了理論基礎(chǔ)。