錢曉慧，陳龍清，李雙琴，施 蕊

(西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650224)

墨紅(RosachinensisJacq.cv. Crimson Glory)和滇紅(RosagallicaL. cv. Dianhong)均為云南主栽的可食用重瓣玫瑰，種植面積超過(guò)500 hm2，花瓣中富含苯乙醇、芳樟醇、香茅醇和香葉醇等芳香物質(zhì)[1-2]，可用于提取精油和香料制作。除此之外玫瑰花中也富含黃酮、多酚、色素、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有排毒養(yǎng)顏、疏肝利膽、舒緩定神、抗菌抗病毒、調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡、降血糖等多種功效[3-4]。謝美玉等[5]為準(zhǔn)確地進(jìn)行品種鑒定，分別對(duì)這兩種食用玫瑰建立了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。張?jiān)Z等[6]研究表明，墨紅玫瑰里多酚含量大于滇紅，但是滇紅和墨紅的生物堿成分研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

生物堿作為一大類研究歷史悠久、結(jié)構(gòu)多樣化的重要天然有機(jī)化合物，在人體或動(dòng)物體內(nèi)具有動(dòng)態(tài)的生物活性，具有抗菌抗炎(小檗堿、血根堿)、鎮(zhèn)痛(嗎啡)、抗瘧(奎寧)、平喘(麻黃堿)、抗癌(喜樹堿)、殺蟲(百部生物堿)和降壓(血利平)、抗老年癡呆(石杉?jí)A甲)等作用，常用于藥品開(kāi)發(fā)和利用，如抗菌藥物甲硝唑和喹諾酮類藥物[7-11]。在眾多的天然產(chǎn)物中，生物堿具有最顯著的功能是針對(duì)癌細(xì)胞的生理功能[12]，但也有一些植物生物堿顯示出毒性，如肝、腎、神經(jīng)、胃腸道和遺傳毒性[13-14]。隨著對(duì)生物堿的深入研究，發(fā)現(xiàn)了靠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、增加活性氧、抑制DNA拓樸異構(gòu)酶形成抗癌活性的新型天然生物堿[15]。但從植物中提取得到的天然代謝產(chǎn)物一般含量較低且價(jià)格較貴。因此，可通過(guò)植物次生代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究，并利用代謝工程手段改善代謝途徑，優(yōu)化提高或減少次生代謝產(chǎn)物量[16]，可更好地發(fā)揮植物的綜合價(jià)值以及進(jìn)行新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。在長(zhǎng)春花吲哚生物堿的代謝途徑中運(yùn)用基因工程等手段對(duì)關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行遺傳改造，讓長(zhǎng)春花藥用成分含量的提高具有了可行性[17]；同樣用基因工程的方法在解析喜樹堿類化合物代謝途徑基礎(chǔ)上，干擾喜樹堿合成代謝流，能在大幅度提高喜樹堿產(chǎn)量的同時(shí)減輕對(duì)細(xì)胞本身的毒性作用[18]；除此之外，在茶葉中人為去除過(guò)量生物堿會(huì)導(dǎo)致茶葉失去特有風(fēng)味，而通過(guò)基因工程等手段來(lái)研發(fā)和培育各種控制生物堿含量的新品茶葉卻有良好的社會(huì)意義[19]。同時(shí)生物堿代謝生物學(xué)的研究成功可為醫(yī)藥及新的化合物提供參考依據(jù)[20-21]。本研究采用代謝組學(xué)方法探討兩種食用玫瑰中生物堿差異代謝物及代謝途徑，可為兩種食用玫瑰進(jìn)一步通過(guò)基因工程開(kāi)發(fā)不同功能類型花卉、食品、醫(yī)藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

墨紅(DH)和滇紅(ZY)玫瑰均采自云南省大理白族自治州(N25O44′14″，E100°9′50″)，海拔1 970 m。墨紅玫瑰，花徑約8～12 cm，花瓣具絲絨觸感，顏色為深紅色，皮刺平直刺，葉卵形，互生；滇紅玫瑰，花徑約7～12 cm，花瓣為鮮紅色，開(kāi)放后逐漸為紫紅色，皮刺斜直刺，葉卵圓或橢圓形，互生[22]。

1.2 方法

1.2.1 試劑

甲醇(Merck)、乙腈(Merck)、乙醇(Merck)為標(biāo)準(zhǔn)品，二甲基亞砜(DMSO)均為色譜純，水為超純水。

1.2.2 儀器

微孔濾膜(0.22 μm pore size)；研磨儀(MM 400，Retsch)；色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；超高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)；串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 4500 QTRAP)。

1.2.3 樣品提取

ZY和DH分2組進(jìn)行代謝研究，DH是對(duì)照組，ZY是實(shí)驗(yàn)組，每組樣品為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，質(zhì)控樣本(mix)由樣本(ZY、DH)提取物等量混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性，保障數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性。樣品花瓣先真空冷凍干燥后用研磨儀(30HZ)研磨1.5 min至粉末狀，并稱取100 mg的粉末，溶解于1.0 mL甲醇水溶液(70%)中；為提高提取率，將制得的提取液樣品于4 ℃冰箱過(guò)夜，期間渦旋3次；最后離心(轉(zhuǎn)速10 000×g，10 min)并吸取上清液，用微孔濾膜過(guò)濾樣品后保存于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.2.4 樣品測(cè)定

色譜流動(dòng)相：水相為超純水(加入0.04%的乙酸)，有機(jī)相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min水/乙腈(體積比95∶5)，11.0 min體積比為5∶95，12.0 min體積比為5∶95，12.1 min體積比為95∶5，15.0 min體積比為95∶5；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V， 簾氣(curtain gas，CUR)25 psi。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB(metware database)及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。并與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合，利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)研究?jī)蓚€(gè)品種之間的代謝組差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物的定性和定量分析

通過(guò)質(zhì)控(quality control，QC)樣本的總離子流圖及MRM代謝物檢測(cè)，對(duì)每個(gè)代謝物在不同樣本中檢測(cè)到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，確保定性定量準(zhǔn)確。樣本的主成分分析結(jié)果(表1、圖1)顯示，ZY、DH、Mix各組之間代謝組呈現(xiàn)分離趨勢(shì)，表明樣品組間代謝組存在差異，其中2D PCA主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)75.57%，3D PCA主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)92.55%。從滇紅(ZY)和墨紅(DH)玫瑰花瓣樣本中共檢測(cè)到82種生物堿代謝產(chǎn)物，包括55種氨基酸及其衍生物、16種生物堿、7種酚胺、4種吲哚類生物堿(圖2)。對(duì)所有樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后的聚類熱圖(圖3)顯示，滇紅(ZY)和墨紅(DH)玫瑰之間的代謝物較明顯分離，與DH相比ZY的生物堿代謝物顯著下調(diào)。

ZY代表滇紅，DH代表墨紅，Mix01、Mix02和Mix03代表滇紅和墨紅提取物等量混合制備的樣本。ZY represented Rosa gallica L. cv. Dianhong， DH represented Rosa chinensis Jacq.cv. Crimson Glory， Mix01， Mix02 and Mix03 represented equivalent mixtures sample of ZY and DH.圖1 各組樣本的二維和三維主成分分析Fig.1 2D PCA and 3D PCA of each sample

表1 滇紅( ZY )和墨紅( DH )玫瑰中所有主成分分析結(jié)果

圖2 所有樣本中鑒定出的不同類型代謝物的數(shù)量Fig.2 Number of different types of metabolites identified in all samples

2.2 差異代謝物篩選及分析

選取差異倍數(shù)值≥2和差異倍數(shù)值≤0.5的代謝物，差異為2倍以上表示上調(diào)，差異為0.5以下表示下調(diào)。滇紅和墨紅玫瑰相比差異倍數(shù)大的前20種差異代謝物(圖4)，上調(diào)的前10種依次為：谷胱甘肽、3-羥丙基棕櫚酸酯葡萄糖胺、N-乙酰-L-酪氨酸、阿魏酸精胺、L-高胱氨酸、阿魏酰組胺、1-甲基組氨酸、胍丁胺、(-)-3-(3，4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸、5-L-谷氨酰-L-丙氨酸；下調(diào)的前10種依次為：L-天冬酰胺、S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸、煙酸甲酯、L-谷氨酸、L-(+)-精氨酸、L-谷氨酰胺、N6-乙酰-L-賴氨酸、L-(+)-賴氨酸、L-(-)-蘇氨酸、甘氨酰-L-脯氨酸。

列表示不同樣本，行表示不同代謝物；顏色深淺表示相關(guān)系數(shù)的值。The columns represented different samples and the rows represented different metabolites; the depth of color represented the value of the correlation coefficient.圖3 DH、ZH和Mix代謝熱圖Fig.3 Heat map of DH， ZH and Mix

綠色表示下調(diào)差異代謝物，紅色表示上調(diào)差異代謝物，數(shù)值表示差異倍數(shù)。Green represented down-regulated differential metabolites， red represented up-regulated differential metabolites， and the value represented the multiple of difference.圖4 ZY與DH相比差異倍數(shù)大的前20種代謝物Fig.4 The top 20 metabolites with fold change between ZY and DH

以ZY為實(shí)驗(yàn)組，DH為對(duì)照組，選取滇紅(ZY)和墨紅(DH)花瓣中差異倍數(shù)值≥2和差異倍數(shù)值≤0.5的差異顯著的代謝物(表2)，總共有18種差異較大代謝物，主要有2種成分：生物堿和氨基酸及其衍生物，其中上調(diào)有3種，分別為N-乙酰-L-酪氨酸(2.56倍)、谷胱甘肽(26.35倍)和3-羥丙基棕櫚酸酯葡萄糖胺(3.45倍)。下調(diào)的有15種，分別為L(zhǎng)-天冬酰胺、煙酸甲酯、L-(-)-蘇氨酸、L-(+)-精氨酸、O-乙酰絲氨酸、DL-2-氨基己二酸、D-(-)-纈氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-(+)-賴氨酸、DL-高半胱氨酸、N6-乙酰-L-賴氨酸、甘氨酰-L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸。其中3-羥丙基棕櫚酸酯葡萄糖胺在滇紅玫瑰中的含量最高，比墨紅玫瑰高3.45倍，屬于生物堿成分；第二豐富的為L(zhǎng)-谷氨酸，是墨紅玫瑰的0.15倍；第三豐富的D-(-)-纈氨酸，是墨紅玫瑰的0.48倍；DL-高半胱氨酸的含量最低，是墨紅玫瑰的0.44倍，但L-天冬酰胺和S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸是墨紅玫瑰中特有的物質(zhì)；滇紅與墨紅相比差異倍數(shù)較大的為谷胱甘肽，為26.35倍。在墨紅玫瑰的顯著差異代謝物中L-天冬酰胺含量最高，其次為L(zhǎng)-谷氨酸、煙酸甲酯和L-(+)-精氨酸。氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，在化妝品、醫(yī)藥和食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，S-腺苷-L-高半胱氨酸是合成半胱氨酸和腺苷的代謝中間產(chǎn)物，胱氨酸是形成皮膚不可缺少的物質(zhì)；天冬酰胺雖不是必需氨基酸，但是天冬酰胺合成酶(ASNS)卻是抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，還可用于制作代糖；精氨酸是一種半必需氨基酸，可促進(jìn)傷口的愈合，刺激生長(zhǎng)激素合成、抗衰老、提高免疫力；纈氨酸等支鏈氨基酸的注射液可治療肝功能衰竭等疾??；谷氨酸可治療肝昏迷等癥狀；賴氨酸作為堿性人體必需且不能自身合成的氨基酸之一，被開(kāi)發(fā)出多種功能性食品和飲料[23-27]。谷胱甘肽與改善線粒體功能有關(guān)，可減輕小鼠酒精性肝病模型肝損傷[28]。

表2 滇紅( ZY )和墨紅( DH )玫瑰中的顯著代謝物

2.3 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

差異代謝物進(jìn)行了KEGG功能注釋后(圖5)，進(jìn)行富集統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要參與了兩種生物合成：氨基酸生物合成途徑和植物次生代謝合成途徑，其中較大的差異代謝組為氨基酸生物合成，數(shù)量為10，占76.92%，富集因子0.59；其次為植物次生代謝合成，數(shù)量為8，占61.54%，富集因子0.47。

為進(jìn)一步研究滇紅和墨紅玫瑰間的差異，差異代謝物在KEGG圖上標(biāo)注(圖6)后顯示，在氨基酸生物合成途徑中ZY顯著下調(diào)的顯著差異代謝物有：S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸、O-乙酰絲氨酸、L-(-)-蘇氨酸、L-谷氨酰胺、DL-高半胱氨酸、L-(+)-賴氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸、L-(+)-精氨酸、L-(-)-蘇氨酸；被檢測(cè)到但無(wú)顯著變化的代謝物有：L-色氨酸、L-(-)-酪氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、2,6-二氨基庚二酸。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)代謝組學(xué)對(duì)滇紅(ZY)和墨紅(DH)玫瑰分析比較后，總共篩選到82種生物堿代謝產(chǎn)物，包括55種氨基酸及其衍生物、16種生物堿、7種酚胺、4種吲哚類生物堿。其中有18種差異較大代謝物，主要有2種成分：生物堿和氨基酸及其衍生物，其中上調(diào)有3種，下調(diào)的有15種。差異代謝物進(jìn)行了KEGG功能注釋后，進(jìn)行富集統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，差異代謝物主要參與了兩種生物合成：氨基酸生物合成途徑和植物次生代謝合成途徑。

圓點(diǎn)的大小表示富集的差異代謝物的數(shù)量，顏色表示顯著值，富集因子表示在對(duì)應(yīng)通路中差異表達(dá)的代謝物的個(gè)數(shù)與該通路檢測(cè)注釋到的代謝物總數(shù)的比值。The size of the dot indicated the amount of enriched metabolites， the color indicated the significant value， and the enrichment factor indicated that the ratio of the number of metabolites differentially expressed in the corresponding pathway to the total number of metabolites detected and annotated by the pathway.圖5 KEGG富集統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Statistic of KEGG enrichment

云南滇紅和墨紅玫瑰中差異代謝物參與的氨基酸代謝不僅僅是增加蛋白質(zhì)合成，還有支持多種免疫細(xì)胞功能[29]，具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。除了酵法及酶法生產(chǎn)氨基酸及其衍生物，也可運(yùn)用綠色生物技術(shù)從植物中增加其含量[30]，綜合利用滇紅和墨紅的顏色與香氣可開(kāi)發(fā)豐富的多功能性產(chǎn)品。鄭淑彥[31]等研究發(fā)現(xiàn)，食用玫瑰中含有所占比例較高的蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等人體必需氨基酸，特別是賴氨酸的含量很高。時(shí)羽杰等[32]用GC-MS技術(shù)以及多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)兩地的白色藜麥種子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽在四川鹽源的藜麥中有更高的表達(dá)水平，較青海都蘭的白色藜麥有更強(qiáng)的抗氧化能力、抗逆性和適應(yīng)性。本研究對(duì)比了滇紅和墨紅玫瑰中的18種差異代謝物，發(fā)現(xiàn)二者之間生物堿成分有一定差距，在滇紅玫瑰的氨基酸生物合成途徑中下調(diào)的就有15種。墨紅玫瑰與滇紅玫瑰相比特有L-天冬酰胺和S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸兩種氨基酸及其衍生物，L-天冬酰胺可作為添加劑與糖共熱反應(yīng)形成特殊香味物質(zhì)，用于清涼飲料[33]。S-(5′-腺苷)-L-高半胱氨酸是半胱氨酸和腺苷合成的中間體，半胱氨酸為人體半必需氨基酸，腺苷常用于藥品制備。而滇紅玫瑰與墨紅玫瑰相比，上調(diào)差異倍數(shù)較大的為谷胱甘肽，是墨紅玫瑰的26.35倍，此代謝物具有較強(qiáng)的清除氧自由基能力。綜上，墨紅玫瑰較滇紅玫瑰有較高的營(yíng)養(yǎng)保健功能，而滇紅玫瑰具有更強(qiáng)的抗氧化能力，因此，可以通過(guò)基因調(diào)控或基因改良的方法對(duì)不同功效的玫瑰品種進(jìn)行優(yōu)選和新品種選育，定向培育，為食用玫瑰的功效物質(zhì)提取，制備功能性食品和生物醫(yī)藥產(chǎn)品奠定了堅(jiān)實(shí)的理論研究基礎(chǔ)。

綠色實(shí)線代表顯著下調(diào)差異代謝物，藍(lán)色虛線代表檢測(cè)到但無(wú)顯著變化差異代謝物。Green lines represented significant down-regulated differential metabolites， blue dotted line represented the detected metabolites with no significant difference.圖6 氨基酸生物合成途徑中DH和ZH的差異代謝物圖Fig.6 Differential metabolites in Biosynthesis of amino acids pathways in DH and ZY