楊曉盼，劉麗莉，黃正迪，李媛媛，郝威銘，張孟軍，史勝娟

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國家級教學(xué)示范中心，食品原料河南省工程技術(shù)研究中心，食品加工與質(zhì)量安全控制河南省國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023)

雞蛋在常溫貯藏條件下品質(zhì)劣變迅速，在劣變過程中，蛋清蛋白出現(xiàn)逐漸變稀的現(xiàn)象(蛋清稀化現(xiàn)象)[1]。關(guān)于雞蛋貯藏期間品質(zhì)變化的報(bào)道有很多。于濱等[2]研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋的品質(zhì)變化動(dòng)力學(xué)級數(shù)與禽蛋品種無關(guān)，不同種類禽蛋在貯藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律基本相似。李紅等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蛋清稀化現(xiàn)象與禽蛋的貯藏條件、貯藏時(shí)間等密切相關(guān)。王曉翠等[4]、方軍[5]認(rèn)為，在貯藏過程中蛋白質(zhì)的變化可能與蛋清稀化有關(guān)。Drabik等[6]研究發(fā)現(xiàn)，雞蛋在貯藏過程中濃蛋白隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸轉(zhuǎn)化為低黏度狀態(tài)；而Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，全蛋液在冷藏條件下，蛋白粒徑和功能特性逐漸降低。這些研究主要報(bào)道了禽蛋貯藏過程中蛋清蛋白理化特性和功能特性的變化情況，關(guān)于蛋清流變特性的研究報(bào)道較少。

蛋白質(zhì)在降解過程中，空間結(jié)構(gòu)打開，分子間作用力與疏水基團(tuán)發(fā)生變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，可能會促使溶液里的蛋白質(zhì)間三維結(jié)構(gòu)形成或降解，進(jìn)而影響其黏度與功能特性[8-10]。蛋清中含有多種蛋白質(zhì)，是個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，其中的蛋白質(zhì)發(fā)生變化時(shí)會互相影響，從而產(chǎn)生一系列復(fù)雜的變化。蛋白含量發(fā)生變化時(shí)，可能會對蛋清的加工特性和流變特性產(chǎn)生影響，但在本研究檢索范圍內(nèi)未見這方面的深入報(bào)道。

本研究以雞蛋清為原料，探究其在貯藏期間蛋清內(nèi)幾種主要蛋白質(zhì)及其流變特性的變化，探索上述變化與蛋清稀化的關(guān)系，旨在為探明蛋清稀化的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，從而為延緩蛋清稀化提供理論支撐，助推我國禽蛋深加工產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、大豆油，購自河南省洛陽市某超市。

溶壁微球菌、溶菌酶標(biāo)品，生工生物工程(上海)股份有限公司；濃鹽酸(分析純)，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(分析純)，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；氫氧化鈉(分析純)，西隴化工股份有限公司；醋酸鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；乙酸(分析純)，萊陽市康德化工有限公司；酒石酸鉀鈉(分析純)、五水硫酸銅(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

H1650型高速離心機(jī)，湘儀集團(tuán)；TDZ5-BP型高速冷凍離心機(jī)，長沙湘銳離心機(jī)有限公司；85-2A型數(shù)顯恒溫測速磁力攪拌器，常州榮華儀器制造有限公司；DHR-2型流變儀，美國沃特世(Waters)公司；DSC1型差示掃描量熱儀，瑞士Mettler-Toledo公司；UV-1100型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將所有雞蛋放置于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，28 d以后，雞蛋出現(xiàn)散黃現(xiàn)象，無法測定，故測試時(shí)長設(shè)置為28 d。其間，每隔4 d取樣，即分別于貯藏0、4、8、12、16、20、24、28 d時(shí)，每次隨機(jī)挑選出3枚雞蛋，外殼洗凈消毒，除去蛋黃，分離蛋清，測定貯藏過程中蛋清的各項(xiàng)指標(biāo)變化，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 主要蛋白質(zhì)的測定

卵黏蛋白含量參照劉美玉等[11]的方法進(jìn)行測定，S-卵白蛋白含量參照黃群[12]的方法進(jìn)行測定，蛋清溶菌酶含量與活力參照王晶[13]的方法進(jìn)行測定。

1.4.2 功能特性的測定

參照李弓中等[14]的方法，起泡性與泡沫穩(wěn)定性采用機(jī)械攪打法進(jìn)行測定，乳化性與乳化穩(wěn)定性采用濁度法進(jìn)行測定。

1.4.3 差式掃描量熱分析(DSC)

用差示掃描量熱儀測定蛋清的熱變性溫度，測定溫度范圍為25～140 ℃，升溫速率10 ℃·min-1，每次樣品用量2～3 mg，氮?dú)饬魉?0 mL·min-1。

1.4.4 蛋清流變特性的測定

參照王雪瑩等[15]和Panaite等[16]的方法，略做修改，測定蛋清的流變特性。測試前，將樣品在室溫(25 ℃)下放置1 h。將樣品置于流變儀感應(yīng)板上，使用C平板進(jìn)行測定，板間距為1 000 nm，平板邊緣過量樣品用塑料刮鏟除去。設(shè)定靜態(tài)流變學(xué)參數(shù)(剪切速率范圍0.01～1 000 s-1)，繪制剪切速率與表觀黏度的關(guān)系圖。設(shè)定動(dòng)態(tài)頻率掃描參數(shù)：固定振蕩應(yīng)變0.3%，頻率變化范圍0.01～300 rad·s-1，測定蛋清儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化規(guī)律。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)。運(yùn)用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，對有顯著(P<0.05)差異的，采用SNK法進(jìn)行多重比較。采用Origin 8.5軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間蛋清主要蛋白質(zhì)含量與溶菌酶活性變化

如表1所示，在貯藏期間，蛋清中的卵白蛋白逐漸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定形式，即卵白蛋白由N-構(gòu)型向S-構(gòu)型轉(zhuǎn)化[17]。由于轉(zhuǎn)化過程不可逆，S-卵白蛋白的含量隨貯藏時(shí)間延長而顯著(P<0.05)增加，至28 d，S-卵白蛋白的含量高達(dá)(92.99±0.81)%。對貯藏時(shí)間與S-卵白蛋白的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，在本試驗(yàn)設(shè)置的25 ℃貯藏條件下，蛋清中S-卵白蛋白含量與貯藏時(shí)間的相關(guān)系數(shù)為0.957 7，相關(guān)性達(dá)到顯著水平(P<0.05)，與付丹丹等[18]的研究結(jié)果一致。

隨著雞蛋貯藏時(shí)間的延長，蛋清中的卵黏蛋白含量顯著(P<0.05)降低。這可能與雞蛋貯藏過程中pH變化導(dǎo)致卵黏蛋白結(jié)構(gòu)降解有關(guān)[11]。隨著貯藏過程中卵黏蛋白的降解，濃蛋白會逐漸轉(zhuǎn)化為稀蛋白。

蛋清中的溶菌酶一部分以游離形式存在，一部分與卵黏蛋白作用形成卵黏蛋白-溶菌酶復(fù)合體。在貯藏初期，蛋清中的溶菌酶含量有明顯升高趨勢，但隨后其活力逐漸降低。這可能是因?yàn)?，在貯藏初期，隨著蛋清濃蛋白的稀化，卵黏蛋白-溶菌酶復(fù)合體逐漸分解，一部分溶菌酶被釋放出來，導(dǎo)致其含量略有升高[3]。同時(shí)，蛋黃中的部分溶菌酶也透過蛋黃膜進(jìn)入蛋清。但隨著貯藏時(shí)間的延長，溶菌酶變性速度加快，導(dǎo)致溶菌酶含量降低。隨著蛋清卵黏蛋白-溶菌酶復(fù)合體逐漸解離出新的溶菌酶，貯藏后期蛋清中的溶菌酶活力產(chǎn)生一定的提高。由此推測，溶菌酶含量的變化也可能是導(dǎo)致蛋清稀化的原因之一[19]。

表1 貯藏期間蛋清中主要蛋白質(zhì)含量與溶菌酶活性的變化

2.2 貯藏期間蛋清的功能特性變化

由表2可以看出，在貯藏過程中，蛋清的起泡性和乳化性表現(xiàn)出顯著(P<0.05)的先增高后降低的趨勢，而泡沫穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性均隨著貯藏時(shí)間的延長顯著(P<0.05)降低。貯藏過程中，蛋清蛋白逐漸分解，折疊蛋白的疏水基團(tuán)逐漸暴露出來[14]。這就導(dǎo)致貯藏初期蛋清的起泡性和乳化性均有一定提高。隨著貯藏時(shí)間繼續(xù)延長，蛋清中的濃蛋白進(jìn)一步分解，可能導(dǎo)致蛋清蛋白間的相互作用減弱，二硫鍵、氫鍵等減少[12]，從而影響蛋清的起泡性和乳化性。

從表1和表2的結(jié)果推測，蛋清的功能特性與其主要蛋白質(zhì)的含量可能具有相關(guān)性。將蛋清中的卵黏蛋白、S-卵白蛋白、溶菌酶含量分別與蛋清的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。蛋清的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性與S-卵白蛋白含量呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)，與卵黏蛋白含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。

2.3 貯藏期間蛋清的差示掃描量熱分析

DSC熱流圖可以反映物質(zhì)熱轉(zhuǎn)變的溫度變化與焓變。蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白在水中的變性溫度分別為61.0 ℃和84.0 ℃，但由于液體蛋清的成分復(fù)雜，DSC峰范圍寬，影響單一蛋白的變性峰，導(dǎo)致無法清晰判斷出蛋白質(zhì)的變性峰。如圖1所示，在貯藏過程中，蛋清的熱焓值呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢。這可能是因?yàn)榈扒宓臒崃鲌D出現(xiàn)重疊峰，導(dǎo)致蛋清焓變受到影響[20]。在貯藏后期，熱焓值增高的原因可能是，S-卵白蛋白的熱穩(wěn)定性更高[18]，卵白蛋白由N型轉(zhuǎn)變?yōu)镾型后，蛋清中S-卵白蛋白含量的上升導(dǎo)致蛋清整體的熱變性溫度升高，焓值增大。在圖1的100～110 ℃之間出現(xiàn)一個(gè)峰，這可能是由蛋清中的S-卵白蛋白熱變性引起的。隨著貯藏時(shí)間延長，蛋清的熱轉(zhuǎn)變溫度逐漸增大?？赡艿脑蚴牵扒逯袧獾鞍诇p少，卵黃膜變得脆弱，無法徹底隔絕蛋清與蛋黃，導(dǎo)致蛋黃中的部分物質(zhì)進(jìn)入蛋清，使得蛋清體系更加復(fù)雜，從而逐漸影響峰值。這與趙金紅等[21]的研究一致。另外，貯藏過程中蛋清中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與聚集狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性降低，也會影響蛋清的熱焓值變化[22]。

表2 貯藏期間蛋清的功能特性變化

表3 蛋清中蛋白質(zhì)含量與蛋清功能特性的相關(guān)性

圖1 貯藏期間蛋清的熱變性溫度與熱焓值變化Fig.1 Changes in thermal denaturation temperature and enthalpy value of albumin during storage

2.4 貯藏期間蛋清的流變特性變化

蛋清為非牛頓假塑性流體，隨著剪切速率增加，其表觀黏度逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的剪切稀化現(xiàn)象[23]。貯藏期間，蛋清表觀黏度的變化主要體現(xiàn)在剪切速率為0～10 s-1時(shí)。如圖2所示，蛋清的表觀黏度在貯藏初期上升，之后隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸下降。蛋清的表觀黏度在第8天達(dá)到最大。在貯藏初期，雞蛋品質(zhì)保持較好，表觀黏度減小程度較弱。同時(shí)，雞蛋通過蛋殼在與外界氣體交換的過程中失水，而水分對表觀黏度的影響在此時(shí)占主要作用，這就使得蛋清液在貯藏初期呈現(xiàn)出黏度上升的現(xiàn)象。到了貯藏后期，蛋清的表觀黏度下降較快。主要原因可能是，蛋清中的濃蛋白減少，蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化，蛋清、蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得稀疏。同時(shí)，卵黏蛋白在貯藏期間的逐漸分解引起分子間的聚集狀態(tài)減弱，對蛋清的表觀黏度變化也產(chǎn)生了一定的影響。此外，卵黏蛋白-溶菌酶復(fù)合體的解離也在一定程度上影響了蛋清的黏度。卵白蛋白在貯藏過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團(tuán)逐漸暴露，可能影響蛋白質(zhì)間的結(jié)構(gòu)，使分子間二硫鍵強(qiáng)度逐漸減弱[24-25]，表觀黏度下降。

圖2 貯藏期間蛋清的表觀黏度變化Fig.2 Viscosity changes of albumin during storage

G′為儲能模量(彈性模量)，即蛋清液隨剪切頻率改變而產(chǎn)生變形的能力[26]；G″為損耗模量(黏性模量)，即剪切頻率發(fā)生改變時(shí)蛋清液的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或蛋白分子聚集狀態(tài)發(fā)生改變消耗的能量[27-28]。從圖3可以看出，蛋清液的流變特性隨剪切力的改變發(fā)生明顯的改變，說明貯藏時(shí)間對蛋清液的流變特性影響較大。當(dāng)剪切的角頻率在0～50 rad·s-1時(shí)，蛋清液存在一定的線性黏彈區(qū)，主要表現(xiàn)出彈性為主的特性，說明蛋清液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)未被剪切力破壞或破壞程度較小[27]。當(dāng)剪切的角頻率超過100 rad·s-1后，前12 d的G′是逐漸增大的，但12 d后G′呈現(xiàn)減小趨勢。G′隨著貯藏時(shí)間的延長而逐漸下降，說明蛋清的凝膠性能逐漸減弱[23，28]，這與表觀黏度的變化規(guī)律一致。可能是因?yàn)镚′與大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪等的固體彈性行為有關(guān)[29]，隨著貯藏后期蛋清中蛋白質(zhì)含量的巨大變化，G′亦相應(yīng)變化。

G″隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸降低。在貯藏前期，不同溫度條件下的G′均大于G″，表現(xiàn)為流體的彈性性質(zhì)[30]；在貯藏后期，G″均大于G′，蛋清表現(xiàn)出黏性特征[29]。在貯藏過程中，蛋清的彈性特征轉(zhuǎn)變?yōu)轲ば蕴卣?，表明蛋清的蛋白含量與結(jié)構(gòu)逐漸變化，出現(xiàn)稀化現(xiàn)象[31]。蛋清在貯藏過程中，彈性特征和黏性特征都逐漸減小，說明其流動(dòng)性增加，即黏度降低，這與表觀黏度的研究結(jié)果相符。

圖3 貯藏期間蛋清流變特性的變化Fig.3 Rheological properties of albumin during storage

3 結(jié)論

本研究表明，蛋清中的蛋白質(zhì)在貯藏過程中會發(fā)生明顯變化，濃蛋白隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸變稀，直到完全水化。在這一過程中，隨著濃蛋白的逐漸減少，卵黏蛋白、卵白蛋白和溶菌酶含量均發(fā)生顯著(P<0.05)變化，說明蛋清中蛋白質(zhì)的含量變化對蛋清稀化有一定影響。同時(shí)，蛋清的功能特性隨著蛋白含量的變化顯著(P<0.05)降低。由于蛋清體系較為復(fù)雜，故而蛋清的差示掃描量熱分析發(fā)生較大變化。蛋清的表觀黏度也逐漸降低，蛋清由主要表現(xiàn)彈性特征轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕憩F(xiàn)黏性特征。這些變化表明，貯藏期間蛋清的蛋白質(zhì)成分變化與其功能特性和流變特性的變化具有一定的關(guān)聯(lián)性。蛋清的稀化受到蛋白質(zhì)含量變化的影響，蛋白質(zhì)的變化會影響蛋清的功能特性，蛋清流變特性的變化可用來表征蛋清稀化的程度。這些變化產(chǎn)生的原因可能是，蛋白質(zhì)的變化使蛋清中的蛋白聚集狀態(tài)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)間的相互作用。今后可嘗試從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與相互作用變化視角進(jìn)一步研究蛋清的稀化現(xiàn)象。