姜興粲，李 冰，楊 敏，張繼瑜，*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050)

沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)是一種具有4-喹諾酮環(huán)結(jié)構(gòu)的喹諾酮類廣譜抗菌藥物，具有較強(qiáng)的抗菌活性[1-2]。沙拉沙星適用于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及霉形體引起的各種感染，特別對(duì)家禽的慢性呼吸道病、大腸埃希菌感染、傳染性鼻炎等療效顯著；豬可用于紅痢、白痢、黃痢、丹毒等；牛用于巴氏桿菌、布氏桿菌感染等；羔羊用于痢疾、大腸桿菌感染等，均有良好的療效。沙拉沙星的常見劑型為粉劑，具有溶解度差、藥物性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。分子包合技術(shù)具有提高溶解度和穩(wěn)定性、改善生物利用度的優(yōu)點(diǎn)。分子微膠囊技術(shù)是以壁材包裹芯材，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)芯材保護(hù)的一種加工方法。經(jīng)過包合后，不僅可以改善芯材的物理性質(zhì)，還可以使芯材免受光、熱等極端環(huán)境的影響。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)做為一種優(yōu)良的藥用輔料可用于沙拉沙星的包合過程，彌補(bǔ)沙拉沙星不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，達(dá)到對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化的目的[3-4]。

響應(yīng)面方法(response surface methodology，RSM)是一種數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)，用于建立經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)于優(yōu)化生產(chǎn)條件具有重要意義。RSM可以減少分析的次數(shù)，快速篩選出設(shè)定指標(biāo)下的工藝參數(shù)，具有成本低、用時(shí)短等特點(diǎn)[5-6]。噴霧干燥是將溶液霧化到熱干介質(zhì)中使之干燥的技術(shù)。霧化產(chǎn)生的液滴能夠在很短的停留時(shí)間內(nèi)有效地將水蒸發(fā)在干燥室中。沙拉沙星耐熱不耐光，可以采用高溫噴霧干燥來(lái)提高干燥效率，干燥過程最終將液體包合物轉(zhuǎn)化為固體粉末，從而易于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，可以更高效地推廣到臨床使用中[7-9]?；谝陨弦蛩?，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化包合作用條件和噴霧干燥工藝參數(shù)，以期為廣譜抗菌藥沙拉沙星的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

沙拉沙星(含量>98%，批號(hào)為20180111)，購(gòu)自廣州楊葉生物科技有限公司；β-環(huán)糊精(β-CD，批號(hào)為20180309)、四丁基溴化銨(AR級(jí)，含量為99%，批號(hào)為20180119)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為20180113)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷酸(HPLC級(jí)，含量為98%，批號(hào)為20180311)，購(gòu)自美國(guó)Kermel公司；乙腈(GR級(jí)，含量為99.98%，批號(hào)為20171009)，購(gòu)自美國(guó)Fisher Chemical公司；氫氧化鈉(含量>96%，批號(hào)為20161113)，購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠；甲醇(GR級(jí)，含量>99.98%，批號(hào)為20171201)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

1290型高效液相色譜儀、數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)為KQ3200DE)、優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司；天平(型號(hào)為BSA423S-CW)，購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；可控溫磁力攪拌器，購(gòu)自德國(guó)IKA公司；離心式噴霧干燥機(jī)(型號(hào)為L(zhǎng)PG-Ⅴ)，購(gòu)自湘宏設(shè)備科技有限公司。

1.2 沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物制備工藝優(yōu)化

研究中制備工藝主要分為包合工藝與干燥工藝兩步。將原料藥用適量碳酸鈉溶解后加入到飽和的β-環(huán)糊精水溶液中，恒溫恒速攪拌直至β-環(huán)糊精充分包合原料藥。當(dāng)增加β-環(huán)糊精比例、提高包合溫度或延長(zhǎng)包合時(shí)間均可以提高包合物制劑的包合率[3，10]。采用響應(yīng)面模型的Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)制備沙拉沙星/β-環(huán)糊精(SAR/β-CD)包合物微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化[11]。以包合率(Y)為效應(yīng)值，選取SAR與β-CD的摩爾比(A)、包合溫度(B)、包合時(shí)間(C)作為3個(gè)因素，因素水平如表1所示。利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)三因素二水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，以包合率為指標(biāo)進(jìn)行篩選(表1)[5-6]。包合率計(jì)算公式如下：包合率(%)=包合物中的藥量/加入的總藥量×100。

1.3 沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物干燥工藝條件優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗(yàn)

分別以干燥度為指標(biāo)，對(duì)進(jìn)氣溫度(℃)和蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速(r·min-1)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，觀察不同進(jìn)氣溫度(D)和不同蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速(E)條件對(duì)干燥度的影響。干燥度計(jì)算公式如下：干燥度(%)=制劑中的水分質(zhì)量/制劑的總質(zhì)量×100%。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

采用響應(yīng)面模型Central-composite設(shè)計(jì)法對(duì)制備SAR/β-CD包合物微膠囊的噴霧干燥條件進(jìn)行優(yōu)化[11]。響應(yīng)面法對(duì)噴霧干燥工藝的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：干燥度≤98%，0分；干燥度>98%，100分。蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速(r·min-1)和進(jìn)口空氣溫度(℃)對(duì)材料的干燥度有顯著影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素和水平，如表2所示[7-9]。

1.4 液相色譜檢測(cè)

表1 包合物制備工藝正交試驗(yàn)因素和水平

表2 噴霧干燥工藝正交試驗(yàn)因素和水平

1.4.1 色譜條件

稱取9.94 mg沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加適量0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶解，配制成質(zhì)量濃度為99.40 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆?。使用前，用流?dòng)相逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在紫外分光光度計(jì)200～800 nm范圍內(nèi)掃描，并在高效液相色譜儀上逐步驗(yàn)證。對(duì)比乙腈-磷酸水溶液體系和乙腈-2%四丁基溴化銨(13∶87，V/V)這2種流動(dòng)相體系中的響應(yīng)值、對(duì)稱度等性能參數(shù)[12]。

1.4.2 線性范圍與檢測(cè)限、定量限

制備質(zhì)量濃度分別為9.94、19.88、29.82、39.76、49.70、59.64、69.58、79.52、89.46、99.40 mg·L-1的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于液相色譜檢測(cè)。應(yīng)用外標(biāo)法以峰面積為縱坐標(biāo)，沙拉沙星濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)樣分析后計(jì)算信噪比，當(dāng)信噪比=3(S/N≥3)時(shí)，該濃度為檢測(cè)限(method detection limit，MDL)，信噪比=10(S/N≥10)時(shí)，該濃度為定量限(limit of quantitation，LOQ)。

1.4.3 精密度與回收率試驗(yàn)

分別配制不同批次低(29.82 mg·L-1)、中(59.64 mg·L-1)、高(99.40 mg·L-1)濃度的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，計(jì)算方法精密度。制備添加空白輔料的不同批次低(29.82 mg·L-1)、中(59.64 mg·L-1)、高(99.40 mg·L-1)濃度的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

1.4.4 SAR/β-CD包合物載藥量測(cè)定

取適量的純凈水，加入準(zhǔn)確稱量的SAR/β-CD包合物，在25 ℃下振蕩12 h達(dá)到平衡，過濾注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)進(jìn)行3次重復(fù)。SAR/β-CD包合物的載藥量計(jì)算公式如下：載藥量=(測(cè)得包合物中鹽酸沙拉沙星的質(zhì)量/包合物的總質(zhì)量)×100%。

1.4.5 SAR/β-CD包合物溶解度測(cè)定

將過量的SAR/β-CD包合物和沙拉沙星原藥分別加入超純水中，在(25±2)℃下攪拌12 h，以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，過濾后注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)進(jìn)行3次重復(fù)[12-14]。

1.5 SAR/β-CD包合物干燥損失試驗(yàn)

參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)，稱取SAR/β-CD包合物1.00 g左右，混合均勻，置于供試品相同條件下干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，在105 ℃干燥箱中干燥至恒重。由減失的質(zhì)量和取樣質(zhì)量計(jì)算供試品的干燥損失。

1.6 高溫穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)，取供試品置于密封潔凈容器中，在60 ℃條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，檢測(cè)制劑的有效物質(zhì)相對(duì)標(biāo)示量的含量、雜質(zhì)量及有關(guān)物質(zhì)量。若供試品發(fā)生顯著變化(如含量下降5%)，則在40 ℃下同法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.7 強(qiáng)光照穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)，取供試品置于裝有日光燈的光照箱中，將最小包裝的產(chǎn)品單層排列，于(4 500±500)lx條件下放置10 d，在第5天和第10天取樣檢測(cè)，檢測(cè)制劑的有效物質(zhì)相對(duì)標(biāo)示量的含量、雜質(zhì)量及有關(guān)物質(zhì)量。

1.8 高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2015版)，取供試品置于恒濕密閉容器中，于25 ℃、相對(duì)濕度(90±5)%條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣進(jìn)行檢測(cè)。若供試品吸濕后質(zhì)量增加5%以上，則應(yīng)在25 ℃、相對(duì)濕度(75±5)%條件下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.9 生物穩(wěn)定性試驗(yàn)

物理混合物和SAR/β-CD包合物在模擬胃液(25 ℃，pH=1.5)中溶解。每隔12 h采集樣本，濾過后注入高效液相色譜儀測(cè)定[15-16]。每次試驗(yàn)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 包合試驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)選

用響應(yīng)面模型建立過程模型的方差分析見表3。由表可知，該模型的P值為0.000 4，極顯著(P<0.01)，表明該模型回歸顯著。

響應(yīng)面圖可反映交互作用的影響程度，趨近于橢圓形表明顯著[17]。通過Design-Expert軟件分析得到最優(yōu)試驗(yàn)參數(shù)為：β-環(huán)糊精與沙拉沙星摩爾比1.83∶1，攪拌溫度47.84 ℃，攪拌時(shí)間3.76 h。經(jīng)過多次驗(yàn)證試驗(yàn)表明，當(dāng)β-環(huán)糊精與沙拉沙星摩爾比為2∶1，攪拌溫度50 ℃，攪拌時(shí)間4 h時(shí)，包合率最大，能滿足生產(chǎn)與應(yīng)用需求。

2.2 干燥工藝條件優(yōu)化

如圖2所示，干燥工藝中，進(jìn)風(fēng)溫度與干燥度成正比，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速與干燥度成反比。

用響應(yīng)面模型建立的過程模型的方差分析見表4。由表4可知，該模型的P值為0.000 7，極顯著(P<0.01)，表明該模型回歸顯著。

表3 回歸模型的方差分析

通過Design-Expert軟件分析得到最優(yōu)試驗(yàn)參數(shù)為：進(jìn)氣溫度約為162 ℃，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速約為6.3 r·min-1[17-18]。經(jīng)過多次驗(yàn)證試驗(yàn)表明，進(jìn)氣溫度為160 ℃、蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為6.3 r·min-1的條件下干燥的包合物具有良好的流動(dòng)性，能滿足生產(chǎn)與應(yīng)用需求。

2.3 液相色譜檢測(cè)

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙拉沙星在280 nm時(shí)有明顯的吸收峰，靈敏度與對(duì)稱度良好。確定的色譜條件為：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm)，柱溫30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-2%四丁基溴化銨(13∶87，V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量5 μL。采用該液相色譜條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)。結(jié)果表明，沙拉沙星質(zhì)量濃度在9.94～99.40 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系優(yōu)良，回歸方程為Y=34.66X-15.867，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 9。檢測(cè)限為0.004 μg·mL-1(S/N≥3)，定量限為0.066 μg·mL-1(S/N≥10)。

表4 回歸模型的方差分析

精密度試驗(yàn)中，高濃度(89.46 μg·mL-1)沙拉沙星平均響應(yīng)值為3 058 mAU*s，標(biāo)準(zhǔn)偏差2.50；中濃度(59.64 μg·mL-1)的平均響應(yīng)值為2 046 mAU*s，標(biāo)準(zhǔn)偏差13.44；低濃度(29.82 μg·mL-1)的平均響應(yīng)值為1 035 mAU*s，標(biāo)準(zhǔn)偏差1.70。高濃度(89.46 μg·mL-1)的回收率平均值為100.21%，RSD 0.15%；中濃度(59.64μg·mL-1)的回收率平均值為99.17%，RSD 0.04%；低濃度(29.82 μg·mL-1)的回收率平均值為101.67%，RSD 0.15%。

2.4 SAR/β-CD包合物干燥損失試驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，在篩選出的噴霧干燥工藝參數(shù)下制備的沙拉沙星包合物含水量小于2%，符合規(guī)定。

2.5 SAR/β-CD包合物載藥量及溶解度

如表6所示，3批次沙拉沙星包合物制劑載藥量的平均值90.33%；平均溶解度為14.69 mg·mL-1。

表5 干燥質(zhì)量損失試驗(yàn)結(jié)果

表6 載藥量及溶解度

2.6 高溫穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

如表7所示，SAR/β-CD包合物在60 ℃下保存5 d和10 d后，單一雜質(zhì)含量小于0.5%，總雜質(zhì)量與有關(guān)物質(zhì)量均小于1%。

2.7 強(qiáng)光照穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

如表8所示，在強(qiáng)光照條件下暴露5 d和10 d后，單一雜質(zhì)含量小于0.5%，總雜質(zhì)量與有關(guān)物質(zhì)量均小于1%。

表7 SAR/β-CD包合物高溫穩(wěn)定性試驗(yàn)

表8 SAR/β-CD包合物強(qiáng)光照穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8 高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

如表9所示，SAR/β-CD包合物在25 ℃、相對(duì)濕度(90±5)%時(shí)吸濕率大于5%。在25 ℃和相對(duì)濕度(75±5)%時(shí)，SAR/β-CD包合物的吸濕率和增重率均小于5%。3批藥物的單雜質(zhì)含量、總雜質(zhì)含量和有關(guān)物質(zhì)含量均小于1%。

2.9 生物穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

在pH 1.5的溶液中，初始48 h內(nèi)，物理混合物和SAR/β-CD包合物中的沙拉沙星濃度減少量相似。但是，從48 h到120 h，SAR/β-CD包合物的沙拉沙星濃度下降幅度明顯小于物理混合物的濃度。120 h時(shí)，物理混合液中游離沙拉沙星的濃度下降了46%，而SAR/β-CD包合物中的沙拉沙星濃度僅下降了17%。

表9 SAR/β-CD包合物高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)

3 討論

飽和水溶液法制備沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物，其工藝過程簡(jiǎn)單、高效，相對(duì)于超聲法具有成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)。研究中以包合率為評(píng)分指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)包合工藝進(jìn)行優(yōu)化并完成了多次驗(yàn)證試驗(yàn)，最終篩選出最優(yōu)的物料處方配比和制備工藝為：攪拌溫度50 ℃，攪拌時(shí)間4 h，沙拉沙星與β-環(huán)糊精摩爾比為1∶2，包合過程對(duì)環(huán)境友好，無(wú)有害物質(zhì)產(chǎn)生。相對(duì)于冷凍干燥法速度慢、成本高，而噴霧干燥法具有生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品特性恒定，全程自動(dòng)可控，適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)噴霧干燥工藝進(jìn)行優(yōu)化并完成了多次驗(yàn)證試驗(yàn)，以干燥度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出噴霧干燥工藝的試驗(yàn)參數(shù)為進(jìn)氣口溫度160 ℃，泵速6.3 r·min-1，獲得的沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物制劑含水量較低，流動(dòng)性好，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存。本研究使用高效液相色譜法測(cè)定沙拉沙星包合物制劑的載藥量與溶解度，經(jīng)驗(yàn)證，測(cè)定沙拉沙星包合物含量的高效液相色譜方法學(xué)研究數(shù)據(jù)良好，3種質(zhì)量控制濃度的回收率平均值都大于90%且小于110%，滿足試驗(yàn)要求。用此種方法檢測(cè)的3批次沙拉沙星包合物制劑平均溶解度為14.69 mg·mL-1，表明包合物制劑性質(zhì)優(yōu)良，滿足實(shí)際需求[12，14]。通過對(duì)此種新型制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明，沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物在60 ℃高溫或高濕度或強(qiáng)光照條件下放置10 d后，供試品各檢測(cè)項(xiàng)未發(fā)生顯著變化，證明3個(gè)批次藥物的各檢測(cè)項(xiàng)均符合規(guī)定。在模擬胃酸溶液的生物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，沙拉沙星包合物制劑的穩(wěn)定性同樣明顯高于未進(jìn)行過包合作用的簡(jiǎn)單物理混合物，說(shuō)明制成包合物新制劑后沙拉沙星的光不穩(wěn)定性得到改善[16，19]。

沙拉沙星是由美國(guó)雅培公司研制的動(dòng)物專用的第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及霉形體均表現(xiàn)出良好的抗菌作用。在市場(chǎng)上具有廣闊的應(yīng)用前景，臨床推廣潛力巨大。但是，市售的藥物主要是沙拉沙星普通粉劑，這種劑型對(duì)提高原料藥溶解度的效果不明顯，仍然有理化性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光顏色變深，甚至發(fā)生強(qiáng)光下部分藥物分解的現(xiàn)象。此次研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物的制備工藝，建立的響應(yīng)面法模型具有顯著性，成功得到了沙拉沙星包合物新劑型，其制備工藝過程簡(jiǎn)單高效、成本低廉，且符合環(huán)保要求，彌補(bǔ)了原有的缺點(diǎn)，既提高了藥物的溶解度，又達(dá)到了大幅度提高藥物穩(wěn)定性的目的，證明了此種包合物新劑型的優(yōu)勢(shì)，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。