田 培，趙慧宇，*，劉之煒，王 嬌，狄珊珊，徐 浩，汪志威，王新全，4，齊沛沛

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江省農(nóng)藥殘留檢測(cè)與控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(杭州)，浙江 杭州 310021)

楊梅是我國(guó)南方地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，楊梅成熟期是果蠅盛發(fā)期，導(dǎo)致?tīng)€果落果，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。調(diào)研和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥滅蠅胺在生產(chǎn)中被用于防治果蠅[1]，一般在楊梅成熟期使用。楊梅沒(méi)有果皮，很多消費(fèi)者不清洗直接食用。鑒于目前楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺的殘留風(fēng)險(xiǎn)尚不明確。因此，開(kāi)展楊梅中滅蠅胺和三聚氰胺農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究十分有必要。

滅蠅胺(cyromazine)又名環(huán)丙氨嗪，化學(xué)名稱(chēng)為N-環(huán)丙基-1， 3， 5-三嗪-2， 4， 6三胺，屬于三嗪類(lèi)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在動(dòng)植物體內(nèi)可通過(guò)脫烷基作用代謝為三聚氰胺。滅蠅胺亦在許多國(guó)家獲準(zhǔn)登記作為農(nóng)藥使用，在我國(guó)主要用于防治菜豆、黃瓜、韭菜等蔬菜上的美洲斑潛蠅和潛葉蠅[2]?？的螤柎髮W(xué)向美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(EPA)遞交的研究報(bào)告表明，滅蠅胺可致動(dòng)物乳房產(chǎn)生腫瘤，其代謝產(chǎn)物三聚氰胺在飲食中劑量大于10 000 mg·kg-1時(shí)會(huì)導(dǎo)致公鼠膀胱腫瘤。為了減少環(huán)境中殘留滅蠅胺對(duì)人類(lèi)的潛在危害，美國(guó)、歐盟、國(guó)際法典委員會(huì)(CAC)和中國(guó)等均制定了嚴(yán)格的食品、畜產(chǎn)品和飼料中滅蠅胺的最大殘留限量。很多國(guó)家也制定了滅蠅胺在水果中的最大限量值(MRL)，例如歐盟規(guī)定了水果中滅蠅胺的MRL為0.05 mg·kg-1；日本規(guī)定了水果(除杧果)中滅蠅胺的MRL為1.0 mg·kg-1，杧果中滅蠅胺的MRL為0.50 mg·kg-1；美國(guó)規(guī)定了杧果中滅蠅胺的MRL為0.50 mg·kg-1；GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了瓜果類(lèi)水果(除西瓜)中滅蠅胺的MRL為0.50 mg·kg-1。2005年，康奈爾大學(xué)向紐州政府建議將滅蠅胺列為“限制使用”的化合物。

現(xiàn)階段暫時(shí)沒(méi)有關(guān)于楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺的國(guó)標(biāo)或行業(yè)檢測(cè)方法，有文獻(xiàn)討論研究其檢測(cè)方法，大多是基于氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等儀器檢測(cè)方法的研究討論。但是液相色譜法響應(yīng)低且對(duì)于干擾物質(zhì)無(wú)法進(jìn)行定性分析，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀法前處理步驟繁瑣；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能夠很好地進(jìn)行定性、定量分析。滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物水溶性強(qiáng)，有機(jī)溶劑提取不完全，加上楊梅偏酸性，含有色素等基質(zhì)干擾，為其檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了挑戰(zhàn)[3]。本研究擬建立楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)方法，通過(guò)優(yōu)化提取溶劑，建立更為高效、快速、有效的前處理方法，并進(jìn)行初步膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，明確楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)，為今后上述目標(biāo)物的風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)和預(yù)警提供檢測(cè)方法技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中選用的空白東魁楊梅樣品來(lái)自臺(tái)州市仙居縣某楊梅基地，且經(jīng)過(guò)檢測(cè)分析不含滅蠅胺和三聚氰胺。

滅蠅胺(純度>99.0%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司)，三聚氰胺(純度>99.0%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司)，乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Merck公司)，氨水(分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)，甲酸[色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司]，三氯乙酸(純度>99.0%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，MCX固相萃取小柱(60 mg，3 mL，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB 4500，AB-SCIEX)，臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，BSA2202S電子天平(北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司)，TTL DCII型氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)，超聲波振蕩器(KQ 500DE，蘇州昆山超聲儀器有限公司)，多通道振蕩器(英芮生化科技有限公司)，固相萃取儀(美國(guó)Suphlco公司)。

1.2 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g(精確到0.01 g)均質(zhì)樣品至50 mL塑料離心管，加入10 mL 1%三氯乙酸，充分振蕩20 min；超聲提取20 min后，再次加入15 mL 1%三氯乙酸，充分振蕩20 min；超聲提取20 min，混勻，5 439×g離心3 min，用10 mL移液管移取10 mL液體，待凈化。

凈化：依次用3 mL甲醇、3 mL水活化固相萃取小柱，將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3 mL水、3 mL甲醇洗滌，抽至近干，用6 mL 5%氨化甲醇分2次洗脫，收集洗脫液；將洗脫液在50 ℃用氮?dú)獯抵两?，殘留物? mL體積比9∶1的乙腈：0.1%甲酸定容，旋渦混合1 min，過(guò)微孔濾膜后，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用空白基質(zhì)提取液將化合物混標(biāo)逐級(jí)稀釋成濃度為0.01、0.02、0.04、0.05和0.10 mg·L-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用體積比9∶1的乙腈：0.1%甲酸溶液將化合物混標(biāo)逐級(jí)稀釋成濃度為0.01、0.02、0.04、0.05和0.10 mg·L-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 LC-MS/MS分析

色譜柱：Omega 1.6 μm-1.8-C18柱(Akzo Nobel公司)，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相為A：5 mmol·L-1乙酸銨和0.1%甲酸水溶液；B：甲醇。梯度洗脫程序?yàn)?—2.0 min，60% B，2.0—6.0 min，95% B，6.0—8.0 min，95% B；8.0—8.2 min，60% B。流速為0.35 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，加熱溫度450 ℃，噴霧電壓為正源5 500 V，負(fù)源4 500 V。目標(biāo)化合物質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

本研究以檢測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用點(diǎn)評(píng)估(PE)方法[4]，對(duì)我國(guó)不同人群的潛在膳食風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。

1.5.1 慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

按照國(guó)際上普遍認(rèn)可的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估原理和方法[4]，用公式(1)估計(jì)每日攝入量(EDI)。

(1)

式(1)中：VEDI為每日攝入量的估計(jì)值，單位為mg·kg-1·d-1；Ci為第i種食物的殘留平均值，單位mg·kg-1；Fi為第i種食物的消費(fèi)量，單位kg·d-1；m為體重，單位kg。

表1 目標(biāo)化合物的LC-MS/MS參數(shù)

慢性攝入風(fēng)險(xiǎn)(RQc)用每日攝入量的估計(jì)值與每日允許攝入量(ADI)的比值表示，按公式(2)計(jì)算。

(2)

式(2)中：VADI為每日允許攝入量的值，單位為mg·kg-1·d-1；VRQc為慢性風(fēng)險(xiǎn)商的值。

1.5.2 急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

采用公式(3)估計(jì)短期攝入量(ESTI)[4]。

(3)

式(3)中：VESTI為短期攝入量的估計(jì)值，單位mg·kg-1·d-1；VHR為采用食物的最大殘留值，單位mg·kg-1；VLPperson為食物的大份餐消費(fèi)量，單位kg·person-1·d-1；m為體重，單位kg。

急性攝入風(fēng)險(xiǎn)用短期攝入量的估計(jì)值與急性參考劑量(ARfD)的比值表示，按公式(4)計(jì)算。

(4)

式(4)中：VARfD為急性參考劑量的值，單位為mg·kg-1·d-1。VRQa為急性風(fēng)險(xiǎn)商的值。當(dāng)VRQa≤1時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)可接受，VRQa越小風(fēng)險(xiǎn)越小；當(dāng)VRQa>1時(shí)，表示風(fēng)險(xiǎn)不可接受，VRQa越大風(fēng)險(xiǎn)越大。

1.6 數(shù)據(jù)來(lái)源

根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]的報(bào)道，滅蠅胺的ARfD為0.10 mg·kg-1·d-1，三聚氰胺的ARfD為2.40 mg·kg-1·d-1。GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定：滅蠅胺的ADI為0.06 mg·kg-1·d-1；三聚氰胺的ADI為0.20 mg·kg-1·d-1，ARfD為2.40 mg·kg-1·d-1[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

滅蠅胺和三聚氰胺的酸度系數(shù)(Pka)分別為7.5[8]和8.0[9]。為了保證待測(cè)物在含有苯酸基團(tuán)的MCX固相萃取柱上得到較好的保留，提取液pH應(yīng)低于待測(cè)物酸度系數(shù)(Pka)值2個(gè)單位。因此，本研究通過(guò)加入三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)萃取液的pH，以保證基質(zhì)中目標(biāo)物在MCX固相萃取柱中可以保留。分別比較了1%三氯乙酸、1%三氯乙酸-乙腈(3+2)、乙酸銨-乙腈(1+4)、乙腈作為提取溶液時(shí)滅蠅胺和三聚氰胺的回收率，結(jié)果表明：1%三氯乙酸作為提取溶劑能夠獲得良好的回收率(表2)，故選擇了1%三氯乙酸作為提取溶劑。

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 方法的線性范圍、相關(guān)性與基質(zhì)效應(yīng)

配制0.01、0.02、0.04、0.05、0.10 mg·L-1的三聚氰胺和滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別得到三聚氰胺和滅蠅胺的線性方程(表3)。三聚氰胺和滅蠅胺在0.01～0.10 mg·L-1線性良好，決定系數(shù)R2均大于0.99。

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)

農(nóng)藥殘留檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)是影響定量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)配制的溶劑標(biāo)和基質(zhì)標(biāo)線性方程，采用基質(zhì)標(biāo)線性方程斜率/溶劑標(biāo)方程斜率來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，斜率之比<1認(rèn)為是基質(zhì)抑制效應(yīng)，若斜率之比>1認(rèn)為是基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。楊梅富含糖分和色素，根據(jù)表中溶劑標(biāo)線性方程斜率和基質(zhì)標(biāo)方程斜率可知，楊梅中滅蠅胺和三聚氰胺均為基質(zhì)抑制效應(yīng)。該結(jié)果與雞蛋中滅蠅胺和三聚氰胺的殘留呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[10]的結(jié)論不同，主要原因是兩者基質(zhì)組成差異造成，雞蛋中富蛋白質(zhì)，而楊梅中富含糖分和色素。因此，檢測(cè)楊梅中滅蠅胺和三聚氰胺殘留時(shí)應(yīng)配制相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

表2 不同提取溶液對(duì)滅蠅胺和三聚氰胺的提取效率

表3 滅蠅胺和三聚氰胺的線性方程、決定系數(shù)、檢出限、定量限

2.2.3 回收率和精密度

以不含滅蠅胺和三聚氰胺的楊梅作為空白基質(zhì)，按在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行回收率和精密度測(cè)定，設(shè)置4個(gè)濃度梯度，分別為0.05、0.10、0.20、0.40 mg·kg-1，分別平行測(cè)定5次。測(cè)定結(jié)果(表4)表明，樣品中滅蠅胺和三聚氰胺的添加回收率分別為77.6%～90.8%和71.6%～84.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

該實(shí)驗(yàn)中滅蠅胺和三聚氰胺經(jīng)1%三氯乙酸溶液提取，用MCX固相萃取柱凈化，然后用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定，通過(guò)外標(biāo)法定量。滅蠅胺和三聚氰胺方法的檢出限均為0.01 mg·kg-1，方法的定量限均為0.05 mg·kg-1。根據(jù)歐盟規(guī)定的水果中滅蠅胺的MRL(0.05 mg·kg-1)和日本規(guī)定的水果(除杧果)中滅蠅胺的MRL(1.0 mg·kg-1)，本方法的檢出限完全滿(mǎn)足水果中對(duì)滅蠅胺的風(fēng)險(xiǎn)篩查需求。該方法簡(jiǎn)便、快速、高效，且能夠滿(mǎn)足楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺的定性和定量分析要求。

2.3 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

本研究采集了來(lái)自浙江臺(tái)州市、金華市、溫州市、杭州市、紹興市、寧波市、舟山市、麗水市等8地的市場(chǎng)和生產(chǎn)環(huán)節(jié)楊梅樣品，共計(jì)212批次，樣品量大可以覆蓋楊梅大部分的主產(chǎn)縣級(jí)市，可真實(shí)反映浙江省楊梅主產(chǎn)區(qū)的農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀。

表4 滅蠅胺和三聚氰胺在楊梅中的添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.3.1 滅蠅胺和三聚氰胺在楊梅中的分布

212批次楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺殘留檢出率分別為2.4%和21.7%，其殘留中值分別為0.05 mg·kg-1和0.02 mg·kg-1，最大殘留值分別為0.13 mg·kg-1和0.08 mg·kg-1(表5)。該檢測(cè)結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)際用藥情況相符。

2.3.2 農(nóng)藥的慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

評(píng)估計(jì)算涉及未檢出農(nóng)藥殘留的樣品，其殘留量按定量限(LOD)計(jì)算。根據(jù)澳大利亞和新西蘭等國(guó)家公布的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算方法[11]，在進(jìn)行膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，慢性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以根據(jù)評(píng)估目的使用檢出的平均值、中值或最大值，通常對(duì)于農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估使用中位數(shù)殘留量而不是算術(shù)平均值，主要原因是農(nóng)藥殘留分布通常為左偏分布而非正態(tài)分布[12]。因此，本研究采用每種農(nóng)藥的殘留中值而不是平均值計(jì)算慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)，以避免高估風(fēng)險(xiǎn)。

為了研究所選2種農(nóng)藥的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)，ADI值采用我國(guó)GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中該農(nóng)藥的推薦值進(jìn)行計(jì)算；其中，楊梅中的農(nóng)藥殘留量以檢測(cè)所得殘留中值計(jì)算。根據(jù)表6可知，滅蠅胺和三聚氰胺的慢性風(fēng)險(xiǎn)商分別為0.001 2和0.000 1，表明楊梅中這2種農(nóng)藥的膳食風(fēng)險(xiǎn)較低，說(shuō)明楊梅不是上述農(nóng)藥的主要慢性膳食風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源。

2.3.3 農(nóng)藥的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)

在評(píng)估楊梅中農(nóng)藥殘留的急性膳食風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，由于缺乏我國(guó)人群的楊梅膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)，通過(guò)問(wèn)卷調(diào)研方式統(tǒng)計(jì)了一般人群對(duì)楊梅的膳食大份餐消費(fèi)量，并采用各農(nóng)藥殘留檢出量的最大值進(jìn)行急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果表明：滅蠅胺和三聚氰胺的膳食急性風(fēng)險(xiǎn)商分別為0.024和0.006，說(shuō)明正常情況下吃楊梅不會(huì)對(duì)人群產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)。

表5 楊梅中農(nóng)藥殘留檢出情況

表6 楊梅中農(nóng)藥殘留膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

3 結(jié)論與討論

本研究建立了固相萃取結(jié)合LC-MS/MS方法測(cè)定楊梅中滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺，該方法前處理簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效，可以用于今后該目標(biāo)物在楊梅中的殘留檢測(cè)。由于滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺均易溶于水，其萃取方法一直是分析的難點(diǎn)問(wèn)題。Yu等[9]利用高壓液相萃取的方法解決這一萃取困難問(wèn)題，然而特殊的儀器設(shè)備和復(fù)雜的萃取步驟大大影響了分析效率。Wang等[13]采用QuEChERS方法，使用乙腈萃取了雞蛋中滅蠅胺及其代謝物三聚氰胺，并獲得了較好的回收率，然而雞蛋中的含水量低，因此，該方法不能適用于含水量高的水果萃取。

由于滅蠅胺在楊梅上未獲得登記，因此，滅蠅胺及其代謝物三聚氰胺的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)需要進(jìn)一步評(píng)估。在評(píng)估楊梅中農(nóng)藥滅蠅胺和三聚氰胺的慢性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，殘留量采用了212批次楊梅中滅蠅胺和三聚氰胺的檢出值，未檢出樣品的殘留量均取其定量限值，因此，保守地估計(jì)了滅蠅胺及其代謝產(chǎn)物三聚氰胺的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)。成人每日楊梅消費(fèi)量為7.5 g，大份餐消費(fèi)量為1 144 g；成人平均體重采用我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)編制時(shí)使用的63 kg。由于近年來(lái)中國(guó)居民的身體條件實(shí)際已發(fā)生了一些變化，該體重?cái)?shù)據(jù)與真實(shí)情況可能存在偏差。另外，由于目前我國(guó)缺乏官方統(tǒng)計(jì)的楊梅膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)，本研究采用了問(wèn)卷調(diào)研的楊梅消費(fèi)量數(shù)據(jù)，問(wèn)卷量和統(tǒng)計(jì)人群代表性有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)，該數(shù)據(jù)已是目前能夠獲取到的最接近楊梅真實(shí)消費(fèi)情況的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。考慮到急性和慢性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)很低，因此，上述不確定因素帶來(lái)的評(píng)估結(jié)果誤差不會(huì)影響最終結(jié)論。