劉 敏，劉宇杰，付寧寧，徐 強，劉玉山，任利利，駱有慶

(北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083)

紅脂大小蠹DendroctonusvalensLeConte，又稱強大小蠹，屬鞘翅目Coleoptera小蠹科Scolytidae，原產(chǎn)于北美洲，傳入我國后，對油松Pinustabuliformis造成嚴(yán)重危害，是一種重大的外來入侵生物。紅脂大小蠹在北美洲原產(chǎn)地分布在北緯15°～55°，包括美國、加拿大和墨西哥、洪都拉斯和危地馬拉(苗振旺等，2000；高寶嘉等，2003；Yanetal., 2005)。在原產(chǎn)地屬于次期性害蟲，主要侵害長勢衰弱或被其他病蟲害危害過的樹木(潘杰等，2011)，受害針葉樹包括松科的松屬Pinus、云杉屬Picea、黃杉屬Pseudotsuga、冷杉屬Abies和落葉松屬Larix等35種以上的針葉樹(趙建興等，2008)。

目前，已知紅脂大小蠹在我國的分布地區(qū)包括山西、陜西、河北、河南、北京等省(市)的大部分區(qū)域，以及甘肅、遼寧、內(nèi)蒙古等省的個別縣市(常寶山等，2001；苗振旺等，2001；劉滿光等，2004；賈洪敏等，2008)。紅脂大小蠹傳入我國后轉(zhuǎn)為初期性害蟲，主要侵害胸徑10 cm以上或樹齡超過30年的健康油松(閆爭亮等，2004；潘杰等，2011；Sunetal., 2013)。在山西還發(fā)現(xiàn)其危害白皮松Pinusbungeana，偶見侵害華山松PinusarmandiiFranch、云杉Piceameyeri、樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica(張歷燕等，2002；Yanetal.，2005；趙建興，2006)，但因危害不嚴(yán)重未引起重視。2017年，在內(nèi)蒙古赤峰市喀喇沁旗旺業(yè)甸林場40年生的樟子松與油松混交林內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)樟子松受紅脂大小蠹的嚴(yán)重危害，而油松受害相對較輕，紅脂大小蠹優(yōu)先選擇樟子松。

紅脂大小蠹在我國屬高危險有害生物，分析該蟲在新的分布地偏好為害寄主發(fā)生變化的原因及潛在的受害寄主，對于其防控具有重要意義。寄主揮發(fā)物在紅脂大小蠹的行為選擇中起重要作用，從樹木中釋放出來的揮發(fā)物可以為小蠹提供長距離和/或短距離的信息素，并且在某些情況下，可以協(xié)同小蠹的聚集信息素發(fā)揮作用(Erbilginetal., 2000；Miller and Borden, 2000; Chenetal., 2013)。Schlyter等提出了小蠹寄主選擇依次經(jīng)歷棲境、寄主樹種、寄主個體3個水平的抉擇(Schlyter and Birgersson,1999)。而無論棲境抉擇或樹種抉擇，紅脂大小蠹都需要依靠寄主釋放的萜烯類揮發(fā)物對寄主做出判斷(段焰青等，2006；姚劍等，2011)。以往我國相關(guān)研究圍繞油松展開，在新發(fā)生地其偏好寄主發(fā)生變化，寄主揮發(fā)物對紅脂大小蠹的吸引作用是否也發(fā)生變化有待研究。本文選擇我國7種主要的針葉樹(包括油松、樟子松、華山松、白皮松、馬尾松、紅松、落葉松)展開試驗。根據(jù)上述文獻(xiàn)資料及我們前期調(diào)查紅脂大小蠹在野外的危害情況，本文將7個樹種劃分為三類：(a)主要危害及偏好危害樹種：油松、樟子松；(b)受害且未造成大面積死亡的樹種：華山松、白皮松；(c)尚未發(fā)現(xiàn)受害的樹種：馬尾松、紅松、落葉松。采集7種樹種木段的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，篩選其中主要萜烯類化合物進(jìn)行紅脂大小蠹的行為選擇反應(yīng)。以期明確寄主樹種主要揮發(fā)性物質(zhì)對新侵入地區(qū)內(nèi)紅脂大小蠹的吸引作用，為理解植物揮發(fā)物對紅脂大小蠹寄主選擇偏好的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試寄主樹種

本試驗中7個樹種的采集地點詳見表1。在不同的采集地點，選取胸徑15 cm、長勢較好的健康松樹，伐倒后截為1 m長的木段，對木段兩端進(jìn)行封蠟保濕，裝入防水密封包裝袋中運輸至內(nèi)蒙古赤峰市黑里河林場。

表1 供試樹種

1.2 供試蟲源

試驗所用的紅脂大小蠹，均采自內(nèi)蒙古赤峰市寧城縣黑里河林場油松林，采集后通過是否可以聽到其摩擦發(fā)聲辨別雌雄(閆爭亮等，2004; Liuetal., 2006)，分性別放置在養(yǎng)蟲盒內(nèi)，供給新鮮油松樹皮韌皮部飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲盒存放于溫度25℃、相對濕度55%、光周期為14 L ∶10 D的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，以備嗅覺行為研究。

1.3 樹干揮發(fā)物的收集鑒定

采用動態(tài)頂空氣體法收集7種寄主樹種的樹干揮發(fā)物，在待測松樹木段距底端20～75 cm處采集。將樹皮表面附屬物清理干凈，用聚乙烯食品級烘烤袋(406 mm×444 mm，Reynolds，Richmond，VA)包裹樹干并做好密封，填充有Tenax TA (60/80 mesh，Supelco，Bellefonte，DE，USA)的鋼制密封管作為吸附管，通過聚四氟乙烯(PVC)軟管鏈接收集袋和吸附管。使用QC-1S大氣采樣儀(北京市勞動保護科學(xué)研究所)將袋內(nèi)空氣抽走，泵入活性炭過濾后的凈化空氣，氣體流量為500 mL/min，密閉循環(huán)采氣120 min。每種寄主樹種隨機采集3段重復(fù)。

在北京林業(yè)大學(xué)大型儀器中心，將采集好的吸附管經(jīng)熱脫附吹掃捕集-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(TCT-GC/MS，PE，CP 4020-Trace 2000/voyager；Perkin Elmer；Finnigan，ThermoQuest，San Jose，CA，USA)分析，色譜條件：毛細(xì)管柱Elite -5 ms，載氣(He)流速2 mL/min，柱長30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚0.25 μm，采取兩級程序升溫方法，初始溫度40℃保持2 min，第1級升溫速率為6℃/min升至180℃保持0 min；第2級升溫速率15℃/min，至270℃保持3 min，共用時34.33 min；質(zhì)譜條件：溶劑延遲1 min，掃描質(zhì)核比范圍29～500 amu。采用TurboMass Ver 6.4.2軟件，通過NIST2017譜圖庫檢索，結(jié)合人工讀圖解析揮發(fā)物的組成成分。

1.4 紅脂大小蠹對不同揮發(fā)物的行為選擇

根據(jù)GC-MS分析結(jié)果并參考以往研究結(jié)果，選擇相對含量較高的7種化合物作為刺激樣品于室內(nèi)進(jìn)行紅脂大小蠹的行為選擇試驗，以正己烷作為溶劑，將7種化合物單體分別稀釋為3個濃度梯度: 10-4、10-2和1 mg/mL(張龍娃等，2009；張蕾蕾，2010)。試驗所用化合物及純度：(1R)-(+)-α-蒎烯(98%)，莰烯(90%)，(-)-β-蒎烯(94%)，月桂烯(90%)，(+)-3-蒈烯(95%)，(S)-(-)-檸檬烯(95%)，萜品油烯(85%)，以上樣品均采購自Sigma試劑公司(美國)。

根據(jù)Ren等的方法，使用自制聚四氟乙烯雙向十通道行為儀測定紅脂大小蠹的行為選擇反應(yīng)(Renetal., 2017)。該行為儀具有10個平行的測道，每個測道的兩個末端各插入一個200 μL的濾芯吸頭，一端吸頭內(nèi)裝有60 μL不同樹種揮發(fā)物的正己烷溶液，另一端吸頭內(nèi)為60 μL正己烷作為對照。經(jīng)過過濾的濕潤空氣經(jīng)由QC-1S大氣采樣儀(北京市勞動保護科學(xué)研究所)以500 mL/min的流速進(jìn)入行為選擇儀的各個末端。通過尼康D810相機(日本)實時拍攝整個行為學(xué)測試存儲為視頻后，使用實時軌跡記錄系統(tǒng)Etho vision XT 14.0(Noldus Information Technology, the Netherlands)識別并分析，統(tǒng)計30 min內(nèi)每頭成蟲移動的總距離及在各區(qū)帶停留的時間。行為儀中雌蟲和雄蟲各放入5頭，在7種物質(zhì)不同濃度條件下各測試1次為一組試驗，每組試驗完成后調(diào)換實驗組和對照組的通氣位置，共重復(fù)6組。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過總離子流峰面積歸一化方法定量，計算揮發(fā)物的相對含量。使用Duncan檢驗分析揮發(fā)性物質(zhì)含量與紅脂大小蠹移動總距離的差異性，采用t檢驗分析紅脂大小蠹在行為選擇實驗中在各區(qū)帶的停留時間的差異性。所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 18.0(IBM，美國)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用prism 8.0(Graphpad Software，美國)繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種植物的揮發(fā)性物質(zhì)分析

通過GC-MS分析，從7種針葉樹的揮發(fā)物氣體樣品中共檢測出包含烯烴類、醇類、酮類、醛類、酯類、酸類、烷烴和芳香烴8類化合物在內(nèi)的54種化合物。其中烯烴類化合物23種，在7個樹種中相對含量均為最大(圖1)。樟子松中共鑒定出35種化合物，烯烴類14種，相對百分含量為50.1%；油松中共鑒定出34種化合物，烯烴類13種，相對百分含量47.9%；馬尾松中共鑒定出35種化合物，烯烴類16種，相對百分含量73.8%；白皮松中共鑒定出29種化合物，烯烴類13種，相對百分含量84.9%，華山松中共鑒定出24種化合物，烯烴類14種，相對百分含量85.3%；紅松中共鑒定出37種化合物，烯烴類19種，相對百分含量為69.8%；落葉松共采集鑒定到化合物37種，烯烴類16種，相對百分含量38.9%。

圖1 不同寄主樹種8類揮發(fā)物相對含量Fig.1 Relative contents of eight types of volatiles in different tree species

利用平方歐式距離—組之間的鏈接法對7種樹種的揮發(fā)物進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，在距離>12并且<13處將其分為兩個集群(A和B)；在距離>9并且<11處，可將A集群進(jìn)一步分為A1和A2組(圖2)。通過主成分分析將7種樹種揮發(fā)物分為3組，與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果一致，水平軸對總揮發(fā)物的解釋率為33.7%，垂直軸的解釋率為20.1%(圖3)。a類主要受害樹種樟子松和油松歸為A1組，b類樹種華山松、白皮松和c類未發(fā)現(xiàn)受害樹種中的馬尾松歸為A2組，c類樹種中的紅松、落葉松歸為B組。

圖2 7種松樹樹干揮發(fā)物聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of volatiles from the trunks of 7 tree species

圖3 7種松樹樹干揮發(fā)物主成分分析得分圖Fig.3 PCA score plot of volatiles from the trunks of 7 tree specie

A組5個樹種揮發(fā)物的共同特征是含有高比例的α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%、53.62%±6.69%、16.89%±2.23%、11.36%±6.18%)，共有的萜烯類化合物包括莰烯、β-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯。同時發(fā)現(xiàn)，A1組中α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%)及莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例顯著高于B組(8.86%±1.07%、9.41%±2.56%)和(0、1.32%±0.52%)(P<0.05)。除此之外，A1組兩樹種中共有的萜烯類化合物還包括(+)-3-蒈烯，A2組包括月桂烯。以上數(shù)據(jù)見表2。故選擇上述7種化合物：(1R)-(+)-α-蒎烯，(-)-β-蒎烯，月桂烯，(+)-3-蒈烯，(S)-(-)-檸檬烯、萜品油烯、莰烯進(jìn)行紅脂大小蠹的行為反應(yīng)(α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯的構(gòu)型參考以往研究結(jié)果選擇(王鴻斌等，2006；張龍娃等，2009；陳海波，2010；陳大風(fēng)等，2013)。

2.2 行為選擇偏好性分析

2.2.1紅脂大小蠹在不同物質(zhì)不同濃度刺激下的移動距離

在30 min內(nèi)，紅脂大小蠹在不同濃度7種化合物刺激下的總移動距離如表3所示。隨著月桂烯(A2組特征性揮發(fā)物)濃度的升高，紅脂大小蠹雌蟲的移動距離呈顯著下降趨勢(P<0.05)；在相同濃度的月桂烯刺激下，紅脂大小蠹雌雄成蟲的移動距離存在差異，在10-4mg/mL的月桂烯刺激下，雌蟲移動距離顯著高于雄蟲(P<0.05)，而在1 mg/mL的月桂烯刺激下，雌蟲移動距離顯著低于雄蟲(P<0.05)。另外，在10-2mg/mL的莰烯刺激下，雌雄成蟲的移動距離均顯著高于其余對照組(P<0.05)，在10-4mg/mL的莰烯刺激下，雄蟲的移動距離顯著低于雌蟲(P<0.05)。其他化合物對紅脂大小蠹總移動距離的影響不顯著。

表3 紅脂大小蠹在不同物質(zhì)不同濃度刺激下30 min內(nèi)的移動距離(cm)

2.2.2紅脂大小蠹在不同區(qū)帶內(nèi)停留的平均時間

在不同濃度各化合物的刺激下，試驗記錄開始后30 min內(nèi)，紅脂大小蠹在不同區(qū)帶的停留時間如圖4所示。雌蟲在10-2mg/mL的(+)-3-蒈烯(t=5.264，P<0.001)，l mg/mL的月桂烯(t=3.796，P<0.005)，1 mg/mL (-)-β-蒎烯(t=3.347，P<0.005)區(qū)帶的停留時間顯著高于對照正己烷組，雄蟲在10-4mg/mL的(S)-(-)-檸檬烯區(qū)帶內(nèi)停留時間顯著高于對照組(t=3.853，P<0.005)。其中(-)-β-蒎烯與(S)-(-)-檸檬烯為A組樹種共有的化合物，(+)-3-蒈烯為A1組樹種的特征性揮發(fā)物，月桂烯為A2組樹種的特征性揮發(fā)物。其他對照條件下沒有顯著差異。

3 結(jié)論與討論

本實驗中7種松樹揮發(fā)物中，α-蒎烯，β-蒎烯，月桂烯，(+)-3-蒈烯， (-)-檸檬烯為主要揮發(fā)性成分，與北美紅脂大小蠹的主要寄主黃松的松脂主要成分相符(Hobsonetal.，1993)。松樹的揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析與主成分分析結(jié)果與目前野外受害情況基本一致，已發(fā)現(xiàn)受害的樹種與未發(fā)現(xiàn)受害的樹種揮發(fā)物分為兩組。除馬尾松外，A組樹種為目前已發(fā)現(xiàn)受害的a類和b類樹種，B組為野外未發(fā)現(xiàn)受害樹種。且A組5個樹種揮發(fā)物的共同特征是含有高比例的α-蒎烯(22.73%±6.12%、26.55%±1.31%、53.62%±6.69%、16.89%±2.23%、11.36%±6.18%)，共有的萜烯類化合物包括莰烯、β-蒎烯、檸檬烯、萜品油烯。通過對比A1組與A2組，發(fā)現(xiàn)A1組中特有的萜烯類揮發(fā)物為(+)-3-蒈烯，A2組特有的萜烯類揮發(fā)物為月桂烯，且A1組莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例高于A2(0.84%±0.1%、0.43%±0.05%、0.15%±0.12%)組。從以上結(jié)果推測，樹種揮發(fā)性物質(zhì)的組成、含量等影響紅脂大小蠹的偏好寄主選擇。

Hobson等在美國的研究認(rèn)為β-蒎烯對紅脂大小蠹的引誘能力最強(Hobsonetal.，1993)，Sun等在中國的研究發(fā)現(xiàn)，3-蒈烯對紅脂大小蠹引誘能力最強，檸檬烯具有抑制引誘的作用 (Sunetal., 2004)。本文中β-蒎烯、檸檬烯為A組樹種共有的揮發(fā)物，(+)-3-蒈烯為A1組樹種特有揮發(fā)性物質(zhì)。與以往研究不同，本研究中1 mg/mL (-)-β-蒎烯與10-2mg/mL (+)-3-蒈烯對雌性紅脂大小蠹均有明顯的吸引作用，(S)-(-)-檸檬烯對紅脂大小蠹雄蟲也有吸引作用。停留時間在本試驗中被選擇作為評價其行為選擇的主要指標(biāo)。統(tǒng)計結(jié)果表明，雌蟲在10-2mg/mL的(+)-3-蒈烯(t=5.264，P<0.001)以及1 mg/mL (-)-β-蒎烯(t=3.347，P<0.005)區(qū)帶的停留時間均顯著高于對照正己烷組，表明上述兩種刺激對紅脂大小蠹雌蟲具有顯著的吸引作用。雄蟲在10-4mg/mL的(S)-(-)-檸檬烯(t=3.853，P<0.005)區(qū)帶內(nèi)停留時間顯著高于對照組，且王鴻斌等證明雄性紅脂大小蠹對檸檬烯的觸角電位反應(yīng)值與對照之間的差異達(dá)到了顯著性的水平(王洪斌等，2006)，這一結(jié)果說明該濃度下(S)-(-)-檸檬烯對紅脂大小蠹雄蟲具有吸引作用。由于紅脂大小蠹在北美原產(chǎn)地就存在對萜烯類化合物反應(yīng)的地理差異(Sunetal.，2004；張龍娃，2007)，推測上述結(jié)果差異可能與紅脂大小蠹對寄主揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)的反應(yīng)出現(xiàn)新的地理變異有關(guān)；或由于本研究在室內(nèi)進(jìn)行，而以往研究為野外試驗，結(jié)果差異與不同溫度條件下?lián)]發(fā)物的釋放速率有關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)莰烯與月桂烯對紅脂大小蠹的行為具有刺激作用。移動距離的結(jié)果顯示，雌蟲在10-4mg/mL月桂烯刺激下以及雌雄成蟲在10-2mg/mL莰烯刺激下活動較為活躍。停留時間的統(tǒng)計結(jié)果顯示，雌蟲在l mg/mL的月桂烯(t=3.796，P<0.005)區(qū)帶的停留時間顯著高于對照正己烷組。莰烯為A組樹種共有的萜烯類揮發(fā)物，且A1組莰烯(2.49%±0.5%、3.17%±0.74%)的比例高于A2組(0.84%±0.1%、0.43%±0.05%、0.15%±0.12%)；月桂烯為A2組特有的萜烯類揮發(fā)物。

值得注意的是，馬尾松與已發(fā)現(xiàn)受害的4個寄主樹種揮發(fā)物較為相似，且與a類樹種樟子松、油松同屬二針?biāo)?，但在自然條件下未見其被危害的報道；需要進(jìn)一步了解紅脂大小蠹的寄主選擇機制，除了寄主植物揮發(fā)性物質(zhì)的影響以外，需綜合考慮當(dāng)?shù)貧夂颉貪穸?，樹皮厚度、營養(yǎng)物質(zhì)、含水量、滲透壓以及流脂等情況，展開進(jìn)一步的研究。

本文研究了我國幾種主要松樹樹干揮發(fā)物的組成及含量。通過主成分分析和聚類分析明確了7種樹種揮發(fā)物的差異性，并與紅脂大小蠹的野外危害情況類比分析，篩選出可能與紅脂大小蠹寄主選擇行為相關(guān)的萜烯類揮發(fā)物進(jìn)行行為選擇試驗。研究發(fā)現(xiàn)紅脂大小蠹的主要寄主樹種油松和新發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢危害樹種樟子松的揮發(fā)性物質(zhì)高度相似，且其中的主要揮發(fā)性萜烯化合物β-蒎烯、檸檬烯、(+)-3-蒈烯對紅脂大小蠹具有吸引作用，莰烯與月桂烯對紅脂大小蠹也有明顯的刺激作用。本研究加強了紅脂大小蠹趨性行為與寄主樹種揮發(fā)性代謝物質(zhì)相互關(guān)系的研究，有助于紅脂大小蠹引誘劑和驅(qū)避劑的開發(fā)，同時進(jìn)一步闡明其寄主選擇機制，為紅脂大小蠹監(jiān)測與控制技術(shù)體系提供重要依據(jù)。

致謝:感謝內(nèi)蒙古赤峰市黑里河林場對本研究的大力支持，為我們提供了試蟲和部分試驗場所。