李根層，趙昱杰，趙 寧，劉乃勇

(西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

昆蟲的表皮覆蓋其整個(gè)體軀，不僅能夠防御病原體的攻擊和不利環(huán)境的傷害，而且在昆蟲發(fā)育過程中對(duì)于體型塑造、水分保持和維持正常的活動(dòng)能力等起著重要作用(Delon and Payre, 2004)。昆蟲表皮的主要成分是表皮蛋白(cuticular proteins, CPs)和幾丁質(zhì)。其中，CP是昆蟲體內(nèi)一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其種類和數(shù)量因種間或同種不同發(fā)育階段而存在差異。因此，CP種類和數(shù)量的變化是昆蟲表皮結(jié)構(gòu)及其機(jī)械性能的重要影響因素(Andersenetal., 1995; Fireetal., 1998)。1982年，Snyder等首次報(bào)道了黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的5個(gè)CP基因(DmelCP1-5)(Snyderetal., 1982)；隨后，Ioannidou等(2014)從黑腹果蠅基因組中共鑒定到228個(gè)CP基因(Ioannidouetal., 2014)。隨著家蠶Bombyxmori、埃及伊蚊Aedesaegypti、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、意大利蜜蜂Apismellifera、赤擬谷盜Triboliumcastaneum等昆蟲完成基因組測(cè)序，已有大量的CP基因得到鑒定，為CP基因家族的進(jìn)化及功能研究提供了重要資源，但是在不同物種間其數(shù)量差異較大(66～305個(gè))(Futahashietal., 2008；Willis, 2010；Ioannidouetal., 2014)。截至目前(2020年1月)，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中收錄的有詳細(xì)描述的昆蟲CP序列已達(dá)數(shù)千條。

基于保守的氨基酸基序，昆蟲的CP蛋白可以劃分為CP-RR(含有Rebers & Riddiford保守基序)、CPF(含一段高度保守的長(zhǎng)為44個(gè)氨基酸的區(qū)域)、CPFL(CPF Like)、Tweedle(含有4個(gè)保守的區(qū)域)、CPAP1(有1個(gè)ChtBD2幾丁質(zhì)結(jié)合域)、CPAP3(有3個(gè)ChtBD2幾丁質(zhì)結(jié)合域)、CPG(有許多短的甘氨酸重復(fù)序列)、CPLC(一類含有低復(fù)雜序列的蛋白，包括CPLCA、CPLCG、CPLCP和CPLCW家族)和Apidermin等12個(gè)家族(Heetal., 2007; Togawaetal., 2007; Willisetal., 2010)。1988年，Rebers和Riddiford通過對(duì)7條CP氨基酸序列的比對(duì)分析，鑒定到CP-RR家族的保守基序?yàn)镚-X(8)-G-X(6)-Y-X-A-X-E-X-G-Y-X(7)-P-X(2)-P(X表示氨基酸，括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為該處X的數(shù)目)(Rebers and Riddiford, 1988)。隨后，有學(xué)者根據(jù)R&R保守基序的差異，將CP-RR分為CP-RR1(主要存在柔軟表皮層)、CP-RR2(主要存在于堅(jiān)硬表皮層)和CP-RR3(目前對(duì)其研究不多，可能參與蛻皮后新表皮的形成)3個(gè)家族(Soaresetal., 2007；劉清明等, 2010)。

昆蟲CP蛋白的種類較多，每類CP基因的功能可能因其所在位置及發(fā)育階段的不同而存在差異(梁九波, 2012)。Guan等(2006)在研究黑腹果蠅的體形時(shí)發(fā)現(xiàn)，TweedleD1基因缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅幼蟲與蛹變短(Guanetal., 2006)。馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata通過調(diào)節(jié)表皮蛋白基因LdecGRP1、LdecGRP2和LdecGRP3的表達(dá)來增加自身對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力(Zhangetal., 2008)。Dittmer等(2012)通過蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜鞘翅中存在大量CP-RR2基因，而CP-RR1基因則集中于柔軟后翅中，表明CP基因的類型對(duì)表皮物理性質(zhì)有重要影響(Dittmeretal., 2012)。赤擬谷盜的TcasCPAP1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致其表皮發(fā)育不全并脫落；而TcasCPAP3-A1和TcasCPAP3-A2基因的缺失則會(huì)影響其鞘翅的發(fā)育(Jasrapuriaetal., 2012)。Arakane等(2012)將赤擬谷盜的TcasCP18和TcasCP27基因沉默后，發(fā)現(xiàn)成蟲鞘翅產(chǎn)生皺褶、彎曲、多孔等癥狀，從而導(dǎo)致成蟲在羽化后因鞘翅過短而不能完整包裹蟲體，進(jìn)而導(dǎo)致成蟲失水死亡，且異形的鞘翅彈性顯著降低，表明這兩個(gè)CP基因?qū)τ诰S持赤擬谷盜鞘翅的形態(tài)和機(jī)械性能是不可缺少的(Arakaneetal., 2012)。此外，赤擬谷盜CP-RR1家族的TcasCPR4基因在其表皮層孔道的形成中具有重要作用(Nohetal., 2015)。綜上所述，昆蟲CP基因在其生長(zhǎng)發(fā)育、體型塑造、表皮和翅的形成等生理過程中具有重要作用。

管紋艷虎天牛Rhaphumahorsfieldi隸屬鞘翅目Coleoptera天?？艭erambycidae虎天牛族Clytini艷虎天牛屬Rhaphuma，主要為害香須樹、木姜子屬、合歡屬以及三臺(tái)核桃等樹木。在國(guó)內(nèi)主要分布于云南、四川、貴州望漠等地(云南省林業(yè)廳等, 1987)，在印度、緬甸、越南、老撾等國(guó)家也有關(guān)于該天牛的相關(guān)報(bào)道(張俊香, 2005)。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該天牛是云南三臺(tái)核桃上新發(fā)現(xiàn)的一種重要蛀干害蟲，每年5-7月，成蟲開始羽化，隨后完成交配、并咬食樹干后，在刻槽內(nèi)產(chǎn)卵，孵化后的幼蟲鉆蛀到樹干木質(zhì)部進(jìn)行取食和為害(尹寧娜等, 2019)。由于管紋艷虎天牛的幼蟲生活在樹干內(nèi)，不易防治；此外，成蟲具有堅(jiān)硬的外表皮，進(jìn)一步加大了防治的難度。目前，管紋艷虎天牛表皮相關(guān)蛋白的研究仍屬空白，如何能夠有效地抑制天牛昆蟲表皮的形成，從而采用化學(xué)防治等方法將其殺死，是昆蟲生理生化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文基于測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)方法在鑒定管紋艷虎天牛CP基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了CP基因家族的序列及結(jié)構(gòu)特征、與鞘翅目其他昆蟲CP基因的進(jìn)化關(guān)系以及組織表達(dá)特征。研究結(jié)果不僅可以為后續(xù)管紋艷虎天牛CP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，還可為該種天牛的防治提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

管紋艷虎天牛采自云南省楚雄州大姚縣三臺(tái)鄉(xiāng)(N26°00′01.6″，E101°04′04.7″)，海拔1 999 m。2016年7月中旬，通過野外采集帶有天牛產(chǎn)卵刻痕的受害核桃木段于室內(nèi)飼養(yǎng)，并保持受害核桃木段水分，待2017年成蟲羽化后收集備用。

分別收集管紋艷虎天牛雌雄成蟲觸角、跗節(jié)及身體其他組織(不含觸角和跗節(jié))，每個(gè)組織收集兩套生物學(xué)模板，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 研究方法

1.2.1基因的鑒定及比較

收集光肩星天牛Anoplophoraglabripennis(McKennaetal., 2016)、馬鈴薯甲蟲(Schovilleetal., 2018)和赤擬谷盜(Ioannidouetal., 2014)的CP蛋白序列，用于管紋艷虎天牛CP基因的鑒定；然后，將管紋艷虎天牛轉(zhuǎn)錄組導(dǎo)入BioEdit軟件中，采用tBlastn同源搜索的方法鑒定管紋艷虎天牛中候選的CP基因；最后，采用Primer Premier 5軟件將已鑒定的基因翻譯成氨基酸序列，在NCBI Nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，每個(gè)RhorCPs僅選擇比對(duì)到光肩星天牛的AglaCPs。

根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，收集鞘翅目、雙翅目、膜翅目和鱗翅目等其他昆蟲的CP基因，分析和比較不同目及同目不同種間CP基因的數(shù)量差異。

1.2.2序列及進(jìn)化分析

采用NCBI Open Reading Frame Finder預(yù)測(cè)RhorCPs基因的開放閱讀框(ORF)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。采用ClustalW軟件進(jìn)行序列比對(duì)(Larkinetal., 2007)。采用WebLogo在線軟件繪制CP-RR1和CP-RR2家族的結(jié)構(gòu)域Logo圖(Crooketal., 2004)，并標(biāo)記保守基序。采用SignalP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽(Petersenetal., 2011)。利用CutProtFam-Pred對(duì)鑒定的RhorCPs基因進(jìn)行不同家族的劃分(Ioannidouetal., 2014)。在結(jié)構(gòu)域分析中，僅選取具有全長(zhǎng)的RhorCPs，采用SMART鑒定RhorCPs的結(jié)構(gòu)域(Letunic and Bork, 2018)，并繪制序列結(jié)構(gòu)域示意圖。

選取管紋艷虎天牛和光肩星天牛的CP序列，首先利用MAFFT v7.388進(jìn)行序列比對(duì)(Katoh and Standley, 2013)；然后，采用FastTree v2.1.5軟件中的SH-like 1000 support方法構(gòu)建CP的進(jìn)化樹(Priceetal., 2010)。進(jìn)化樹的編輯和可視化采用FigTree v1.4.4軟件進(jìn)行(http://tree.bio.ed. ac.uk/software/figtree/)。

1.2.3基因的表達(dá)水平研究

采用Bowtie軟件將測(cè)序獲得的reads比對(duì)到unigenes數(shù)據(jù)庫，然后利用RSEM對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，最后采用FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced，即每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目)值比較不同CP基因在同一樣本或同一CP基因在不同樣本間的表達(dá)量(Trapnelletal., 2010)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的FPKM值及基因?qū)?yīng)的編號(hào)，找到每個(gè)基因在不同組織的FPKM值，然后取兩次重復(fù)的FPKM平均值研究CP基因在不同組織的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 管紋艷虎天牛CP基因的鑒定

基于管紋艷虎天牛的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用Blast同源搜索的方法一共鑒定到108個(gè)CP基因，包括7個(gè)家族成員(表1)：41個(gè)CP-RR1、30個(gè)CP-RR2、8個(gè)CPAP1、7個(gè)CPAP3、3個(gè)CPCFC、14個(gè)CPU和5個(gè)TWDL。在CP-RR1基因家族中，16個(gè)基因具有全長(zhǎng)序列，編碼105～239個(gè)氨基酸；剩余25個(gè)基因?yàn)槠?，編碼88～410個(gè)氨基酸。在CP-RR2基因家族中，13個(gè)基因具有全長(zhǎng)序列，編碼113～340個(gè)氨基酸；剩余基因?yàn)槠?，編碼88～252個(gè)氨基酸。在CPAP1基因家族中，CPAP1.4和CPAP1.7具有全長(zhǎng)ORF，分別編碼172和129個(gè)氨基酸。在CPAP3家族中，CPAP3.2和CPAP3.6是全長(zhǎng)序列，分別編碼238和255個(gè)氨基酸。在CPCFC家族中，CPCFC2和CPCFC3是全長(zhǎng)序列，分別編碼214和186個(gè)氨基酸。在CPU家族中，4個(gè)基因(CPU2、CPU10、CPU13和CPU14)具有全長(zhǎng)序列，編碼177～1 093個(gè)氨基酸。在TWDL家族中，所有5個(gè)基因均為片段，其中最長(zhǎng)的是TWDL1，編碼465個(gè)氨基酸；最短的是TWDL3，編碼153個(gè)氨基酸(表1)。NCBI Blast比對(duì)結(jié)果表明，在具有全長(zhǎng)序列的CP基因中，RhorCPAP3.2與AglaCPAP3.4(GenBank登錄號(hào)：XP_018569398.1)一致性最高，為92%；RhorCP-RR1.10與AglaCP-RR1.28(GenBank登錄號(hào)：XP_018568269.1)的氨基酸一致性最低，僅為38%(表1)。

表1 管紋艷虎天牛CP基因的信息Table 1 Information for cuticular protein genes in Rhaphuma horsfieldi

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 不同昆蟲間CP基因的數(shù)量比較

為了比較管紋艷虎天牛與其他昆蟲CP基因的數(shù)量差異，從已發(fā)表文章中收集了鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目和直翅目等12種昆蟲的CP基因。相比于其他昆蟲，管紋艷虎天牛的CP基因數(shù)量多于直翅目的東亞飛蝗Locustamigratoria、膜翅目的意大利蜜蜂和麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis(表2)。與同目其他昆蟲相比，管紋艷虎天牛的CP-RR1家族的基因數(shù)量?jī)H多于赤擬谷盜；CP-RR2家族的基因少于其他3個(gè)物種；CPU家族的基因數(shù)量多于光肩星天牛，但是少于馬鈴薯甲蟲和赤擬谷盜；在管紋艷虎天牛中未鑒定到CPF家族的基因；所有鞘翅目昆蟲均不含CPLCW基因；其他CP家族在鞘翅目不同種間基因數(shù)量相近。與非鞘翅目昆蟲相比，管紋艷虎天牛的CP-RR2和CPAP1均少于雙翅目、鱗翅目和半翅目昆蟲；CP-RR1僅少于雙翅目和鱗翅目昆蟲(表2)。

2.3 管紋艷虎天牛CP基因家族的結(jié)構(gòu)域分析

結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，所有檢測(cè)的RhorCPs均具有信號(hào)肽序列；在CP-RR1和CP-RR2中，所有CP-RRs均具有保守的Chitin_bind_4結(jié)構(gòu)域，僅CP-RR2.21含有盤管區(qū)；此外，RhorCPs在低復(fù)雜區(qū)的有無、數(shù)量及位置上也存在差異(圖1)。與其他昆蟲CPAP1類似，CPAP1.4和CPAP1.7包含1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)ChtBD2結(jié)構(gòu)域；CPAP3.2和CPAP3.6則包含1個(gè)信號(hào)肽和3個(gè)ChtBD2結(jié)構(gòu)域；兩個(gè)RhorCPCFCs間差異較大，共有結(jié)構(gòu)域?yàn)樾盘?hào)肽和CPCFC結(jié)構(gòu)域，此外CPCFC2還包含1個(gè) SCOP結(jié)構(gòu)域，而CPCFC3包含兩個(gè)低復(fù)雜區(qū)；在4個(gè)RhorCPUs家族成員中，僅CPU13具有Chitin_bind_4結(jié)構(gòu)域，其余成員均不含保守的結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.4 管紋艷虎天牛CP家族的保守基序分析

利用WebLogo在線工具對(duì)CP家族結(jié)構(gòu)域的氨基酸保守基序進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，CP-RR1和CP-RR2家族的保守基序分別為G-X(8)-G-X(6)-Y-X-A-X-E-X-G-F(圖2-A)和G-X-Y-X(5)-D-G-X(6)-Y-X-A-X(4)-G-F(X表示保守的氨基酸；數(shù)字表示氨基酸數(shù)量)(圖2-B)。

圖1 管紋艷虎天牛CP序列結(jié)構(gòu)域特征Fig.1 Characteristics of cuticular protein domains of Rhaphuma horsfieldi

圖2 管紋艷虎天牛CP-RR1(A)和CP-RR2(B)保守基序的WebLogo分析Fig.2 WebLogo analysis of conserved motifs of CP-RR1 (A)and CP-RR2 (B)families from Rhaphuma horsfieldi注：*表示保守的氨基酸殘基；CP-RR1和CP-RR2保守基序模式在序列上方出示。Note:* represented conserved amino acid residues. Conserved motifs of CP-RR1 and CP-RR2 were presented on the top of sequences, respectively.

2.5 管紋艷虎天牛CP基因的進(jìn)化分析

利用FastTree軟件，構(gòu)建了管紋艷虎天牛與光肩星天牛共293個(gè)CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，兩種天牛的CP可劃分為8個(gè)家族(圖3)：CPR-RR1、CPR-RR2、CPAP1、CPAP3、CPCFC、CPF、TWDL和CPU。除CPF家族外，RhorCPs在其余7個(gè)家族中均有分布，兩種天牛大部分的CP均為同源基因，且與光肩星天牛的AglaCPs具有較高的氨基酸一致性。此外，CPAP1和CPU家族聚類到好幾個(gè)分支；CPAP3家族分散到兩個(gè)分支；CP-RR1和CP-RR2家族聚類相對(duì)集中；CPCFC、CPF和TWDL家族僅聚類到一個(gè)大的分支(圖3)。

圖3 管紋艷虎天牛和光肩星天牛CP的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of cuticle proteins from Rhaphuma horsfieldi (Rhor)and Anoplophora glabripennis (Agla)

2.6 管紋艷虎天牛CP基因的表達(dá)譜分析

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的FPKM值，研究了RhorCPs基因在不同組織的表達(dá)譜。結(jié)果表明，大部分CP-RR1基因在檢測(cè)的組織中表達(dá)量均較低(圖4-A)。然而，CP-RR1.14和CP-RR1.20在所有組織中均有較高表達(dá)；部分基因呈現(xiàn)組織特異或高表達(dá)的特點(diǎn)，如CP-RR1.1和CP-RR1.7在雄蟲身體(不含觸角和跗節(jié))中特異表達(dá)，CP-RR1.11在雌蟲身體(不含觸角和跗節(jié))中特異表達(dá)，CP-RR1.29和CP-RR1.35在雌蟲觸角特異表達(dá)，CP-RR1.16和CP-RR1.40在雌蟲觸角高表達(dá)，CP-RR1.12在雌蟲跗節(jié)高表達(dá)，CP-RR1.19在雌雄蟲跗節(jié)高表達(dá)，CP-RR1.24在雌雄蟲觸角和跗節(jié)均有較高表達(dá)(圖4-A)。

圖4 管紋艷虎天牛CP基因在雌雄成蟲不同組織的表達(dá)譜Fig.4 Expression profile of cuticle protein genes in different tissues of Rhaphuma horsfieldi注：A，RhorCP-RR1基因的組織表達(dá)譜；B，RhorCP-RR2基因的組織表達(dá)譜；C，其他家族RhorCPs基因的表達(dá)譜?；虻谋磉_(dá)水平用兩次重復(fù)的FPKM平均值表示。MA，雄蟲觸角；MTa，雄蟲跗節(jié)；MB，不含觸角和跗節(jié)的雄蟲身體；FA，雌蟲觸角；FTa，雌蟲跗節(jié)；FB，不含觸角和跗節(jié)的雌蟲身體。Note: A, Expression profiles of RhorCP-RR1 genes; B, Expression profiles of RhorCP-RR2 genes; C, Expression profiles of other RhorCP genes. Gene expression levels were shown by mean FPKM values with two replicates. MA, male antennae; MTa, male tarsi; MB, male bodies without antennae and tarsi; FA, female antennae; FTa, female tarsi; FB, female bodies without antennae and tarsi.

與CP-RR1類似，大部分CP-RR2基因在檢測(cè)的所有組織中也僅有微弱表達(dá)(圖4-B)。然而，CP-RR2.17在所有檢測(cè)的組織中均有較高表達(dá)，且呈現(xiàn)雌雄蟲跗節(jié)高表達(dá)的特點(diǎn)；CP-RR2.14和CP-RR2.18在雌雄蟲觸角中高表達(dá)；CP-RR2.13、CP-RR2.16、CP-RR2.18、CP-RR2.19和CP-RR2.20在雌雄蟲觸角和跗節(jié)中高表達(dá)，且CP-RR2.13呈現(xiàn)雌蟲觸角偏好表達(dá)的特點(diǎn)，CP-RR2.16呈現(xiàn)雄蟲觸角偏好表達(dá)的特點(diǎn)，CP-RR2.20呈現(xiàn)雄蟲觸角和跗節(jié)偏好表達(dá)的特點(diǎn)(圖4-B)。

在CPU基因家族中，CPU6和CPU7在所有組織中具有較高表達(dá)，且CPU6呈現(xiàn)雌蟲跗節(jié)高表達(dá)的特點(diǎn)；CPU5、CPU9、CPU13和CPU14在所有組織中表達(dá)量均較低；CPU3和CPU8在雌雄蟲觸角和跗節(jié)高表達(dá)，且呈現(xiàn)雄蟲跗節(jié)高表達(dá)的特點(diǎn)。在兩個(gè)CPAP家族中，所有CPAP1基因在測(cè)序的大部分組織中表達(dá)量均較低，其中CPAP1.3在雌蟲觸角高表達(dá)；CPAP3.1、CPAP3.2和CPAP3.5在雌雄蟲觸角和跗節(jié)中高表達(dá)，CPAP3.4在所有組織中均有較高表達(dá)，CPAP3.3在所有組織中僅有微弱表達(dá)。在剩余的兩個(gè)家族中，CPCFC1在雌雄蟲觸角和跗節(jié)中高表達(dá)；CPCFC2在所有檢測(cè)的組織中表達(dá)量較低；CPCFC3在雌蟲跗節(jié)中高表達(dá)。5個(gè)TWDL基因在所有組織中僅有微弱表達(dá)(圖4-C)。

3 結(jié)論與討論

昆蟲的表皮是昆蟲體壁皮細(xì)胞分泌物形成的一種高度有序的層狀結(jié)構(gòu)，是昆蟲抵御外界不良環(huán)境的第一道防線(Andersenetal., 1995; Vincent and Wegst, 2004)。昆蟲表皮的主要成分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)，因此表皮蛋白是昆蟲極為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在昆蟲生存和繁衍中必不可少(梁九波, 2012)。本研究基于測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從管紋艷虎天牛中共鑒定到108個(gè)CP基因，其中CP-RR1占所有基因的37.96%、CP-RR2占27.78%、CPAP1占7.41%、CPAP3占6.48%、CPCFC占2.78%、CUP占12.96%和TWDL占4.63%，該比例與黑腹果蠅CP基因在不同家族中的比例類似，但是不同于其他物種的CP基因家族，在其他物種中多為CP-RR2所占比例最高，其次為CP-RR1(Ioannidouetal., 2014)。

光肩星天牛是天?？评ハx中具有基因組、且已完成CP基因家族注釋的物種(McKennaetal., 2016)，在基因鑒定、序列比對(duì)和進(jìn)化分析中，選取光肩星天牛CP基因家族作為參考序列更有利于分析管紋艷虎天牛的CP基因家族。其中，在管紋艷虎天牛中僅有39個(gè)CP基因(39/108，36.11%)具有全長(zhǎng)序列，可能與測(cè)序組織及CP基因的發(fā)育表達(dá)特征有關(guān)，因?yàn)槔ハx的CP基因主要在幼蟲蛻皮、化蛹階段、羽化階段、成蟲表皮等組織和發(fā)育階段有較高表達(dá)(Liangetal., 2010; Chuetal., 2013; Dittmeretal., 2015; 付丹影等, 2016)，而本研究并未對(duì)幼蟲、蛹及表皮等組織進(jìn)行測(cè)序；同時(shí)，這也可能是管紋艷虎天牛轉(zhuǎn)錄組中獲得較少CP基因的原因之一。在基因數(shù)量的比較中，除膜翅目與直翅目外，管紋艷虎天牛CP基因的數(shù)量均少于鞘翅目等其他昆蟲(Ioannidouetal., 2014)，而其他物種的CP基因均來源于基因組，表明管紋艷虎天?？赡苋杂胁糠諧P基因未得到鑒定。從CP基因不同家族的分析結(jié)果來看，除雙翅目昆蟲(Loannidouetal., 2014)外，其他昆蟲均不含有CPLCW基因；此外，天?？?、膜翅目、半翅目和直翅目等昆蟲還缺失CPLCA和CPLCG基因，暗示昆蟲在進(jìn)化過程中很可能因外界環(huán)境(如生境)的影響而導(dǎo)致CP基因家族的收縮或擴(kuò)張(付丹影等, 2016)。

昆蟲CP-RR家族保守基序的起始通常為G-X(8)-G-X(6)-Y，通常不會(huì)因物種及CP-RR數(shù)量的增加而發(fā)生改變(Willisetal., 2010; 付丹影等, 2016)。在管紋艷虎天牛中，RR1和RR2家族均具有1個(gè)保守的Chitin_bind_4結(jié)構(gòu)域，其中RR1家族完全符合經(jīng)典的R&R基序G-X(8)-G-X(6)-Y，而RR2家族保守基序?yàn)镚-X-Y-X(5)-D-G-X(6)-Y，與R&R保守基序相比出現(xiàn)了保守的酪氨酸(tyrosine, Y)與天冬氨酸(aspartic acid, D)。Hamodrakas等(2002)研究發(fā)現(xiàn)，芳香族氨基酸殘基(主要為酪氨酸Y與苯丙氨酸P)會(huì)形成一個(gè)疏水平面，以阻止幾丁質(zhì)的堆疊(Hamodrakasetal., 2002)。因此，管紋艷虎天牛CP-RR2家族結(jié)構(gòu)域中的保守氨基酸殘基Y很可能有利于加強(qiáng)蛋白質(zhì)與幾丁質(zhì)的結(jié)合。類似的結(jié)果在蔥蠅Deliaantiqua的CP-RR2家族中也有發(fā)現(xiàn)(付丹影等, 2016)?；诠饧缧翘炫：凸芗y艷虎天牛的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)物種間CP具有較高的氨基酸一致性，說明天牛科昆蟲CP間具有相對(duì)高的保守性，在功能上主要參與表皮的形成和發(fā)育。此外，在CP-RR1和CP-RR2家族中，光肩星天牛部分CP基因呈物種聚類分布模式(McKennaetal., 2016)，但在管紋艷虎天牛中僅RR1中具有一個(gè)聚類分支(RhorCP-RR1.10/12/13/30/38)，鑒于AglaCPs基因是從基因組中鑒定，而RhorCPs基則是從轉(zhuǎn)錄組中獲得，表明管紋艷虎天牛的這一CP聚類分支可能是物種特異的分支。

昆蟲CP基因主要在幼蟲、蛹和成蟲的表皮組織中表達(dá)，但在其他組織中也有發(fā)現(xiàn)。中華蜜蜂Apiscerana的AcerCP24基因在蛹后期的表皮、肌肉、腦和中腸中均有表達(dá)，且呈現(xiàn)中腸高表達(dá)的特點(diǎn)(Chuetal., 2013)。在黑腹果蠅中，DmelTWDLs基因在表皮、前腸、氣管和胚胎等組織中高表達(dá)(Guanetal., 2006)。家蠶的BmorCP4基因在腹部表皮組織中表達(dá)，BmorCP9基因在胸部表皮中表達(dá)(Alietal., 2012)；而BmorTWDLs基因則主要在表皮和翅原基表達(dá)(Futahashietal., 2008)。此外，赤擬谷盜的TcasCPAP1和TcasCPAP3基因參與到發(fā)育、蛻皮、表皮形成、產(chǎn)卵等生理過程(Jasrapuriaetal., 2012)。與其他昆蟲CP基因的表達(dá)特征類似，管紋艷虎天牛RhorCPs基因的表達(dá)譜也具有多樣性，即RhorCPs基因在雌雄蟲觸角、跗節(jié)、身體等一至多個(gè)組織有表達(dá)，暗示它們很可能具有多種功能。值得注意的是，部分RhorCPs基因(RhorCP-RR1.16、CP-RR1.19、CP-RR2.17、CPAP3.4、CPU6、CPCFC1等)在觸角或跗節(jié)中特異或高表達(dá)，推測(cè)這些基因可能具有嗅覺或味覺方面的功能。