連凱琪,孟 蕊,王夢(mèng)婷,張向麗,王國(guó)棟,張明亮,張坤朋*,周玲玲*

(1.安陽(yáng)工學(xué)院 河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/河南省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心/博士后創(chuàng)新基地,河南 安陽(yáng) 455000;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046)

沙門(mén)菌的危害主要表現(xiàn)在能導(dǎo)致人和動(dòng)物感染傷寒、副傷寒和胃腸炎等疾病,還可以引起食物中毒,嚴(yán)重危害公共健康安全[1]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性可通過(guò)食物鏈傳播最終對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。目前臨床治療有四環(huán)素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)等多種抗菌藥物,養(yǎng)殖業(yè)普遍采用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物進(jìn)行治療[3]。但由于長(zhǎng)期不合理使用或?yàn)E用抗生素類(lèi)藥物,使沙門(mén)菌的耐藥問(wèn)題每況愈下[4-5]。為避免耐藥性的提高,尋找抗生素替代品或協(xié)同藥物成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題[6-7]。

前期研究發(fā)現(xiàn),4-萜烯醇對(duì)革蘭陽(yáng)性菌中的金黃色葡萄球菌(S.aureus)具有良好的抗菌活性[8]。本試驗(yàn)選擇沙門(mén)菌作為代表菌株,研究4-萜烯醇對(duì)革蘭陰性菌的抗菌作用。通過(guò)對(duì)4-萜烯醇處理過(guò)的沙門(mén)菌的形態(tài)進(jìn)行觀察,同時(shí)對(duì)沙門(mén)菌胞內(nèi)ATP、堿性磷酸酶等內(nèi)容物泄露情況檢測(cè),證明4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌具有良好的體外抗菌效果,可以破壞沙門(mén)菌的細(xì)胞膜,增大其通透性。本研究為進(jìn)一步深入探索4-萜烯醇的抗菌機(jī)制提供了思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑沙門(mén)菌ATCC 13076(血清型:O1,9,12:Hg,m:-)由河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存。濃度≥95%的4-萜烯醇溶液(貨號(hào)W224847)購(gòu)自Sigma-Aldrich;DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒與三磷酸腺苷(ATP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beytime;電鏡固定液購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、胰蛋白胨、酵母浸出物、肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定取100 μL 過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)菌,用滅菌的 PBS緩沖液稀釋至2×105CFU/mL。在超凈工作臺(tái)中取出4排96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,第1行每孔加入50 μL氨芐霉素作為陽(yáng)性對(duì)照;第2行每孔加入50 μL滅菌PBS作為陰性對(duì)照;第3,4行的第1孔加入4-萜烯醇,終濃度為0.128 mol/L,然后倍比稀釋至第8孔。各孔再加入50 μL稀釋好的菌液,封口后置37℃培養(yǎng)16 h。每孔加入10 μL刃天青溶液,再次用封口膜覆蓋,37℃恒溫培養(yǎng)30～60 min,期間觀察顏色變化。有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)刃天青溶液由藍(lán)紫色變?yōu)榉奂t色,最后1個(gè)藍(lán)紫色孔的4-萜烯醇濃度即為其對(duì)沙門(mén)菌的MIC。

1.3 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌時(shí)間抑菌曲線將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的沙門(mén)菌按體積比1∶100轉(zhuǎn)接至4個(gè)滅菌試管中,每管加入不同體積的4-萜烯醇溶液,使其終濃度分別為1,4,8 MIC,另一組加滅菌 PBS 作為陰性對(duì)照。將試管置于恒溫?fù)u床37℃、220 r/min培養(yǎng),每隔2 h取1次樣,取至12 h,然后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h再取樣1次。每次取樣后用封口膜覆蓋并于4℃保存。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量所取樣品在600 nm 處的D值。

1.4 掃描電子顯微鏡觀察將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成2管。加入適當(dāng)體積的4-萜烯醇溶液,使其終濃度為1 MIC,同時(shí)用滅菌PBS設(shè)置陰性對(duì)照。37℃水浴1 h,4 000 r/min離心5 min,棄上清液,無(wú)菌PBS洗滌2次。用電鏡固定液重懸,室溫條件下固定菌體2 h后,于4℃保存,送武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行樣品處理和觀察。

1.5 核酸與蛋白質(zhì)泄露檢測(cè)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成4管。向重懸液中加入4-萜烯醇(終濃度分別為1,4,8 MIC),并用滅菌PBS設(shè)置陰性對(duì)照。于37℃水浴中孵育,每隔1 h取200 μL樣品,4 000 r/min離心5 min,取上清液測(cè)定D260和D280的值。

1.6 ALP含量測(cè)定將培養(yǎng)好的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成5管。其中3管加入4-萜烯醇(終濃度分別為1,4,8 MIC),同時(shí)設(shè)置PBS作為陰性對(duì)照和0.3%的Triton X-100作為陽(yáng)性對(duì)照。將樣品37℃水浴1 h。12 000 r/min 離心5 min,分離上清于新離心管中用于后續(xù)測(cè)定。按照說(shuō)明書(shū)要求配置標(biāo)準(zhǔn)品和顯色底物,低溫保存。取96孔板,第1列每孔加不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品工作液和檢測(cè)緩沖液,再加50 μL的顯色底物用吸液槍吹打混勻。其余孔分別加入50 μL樣品,再加入50 μL顯色底物用吸液槍吹打混勻。用封口膜覆蓋,放置在恒溫培養(yǎng)箱,37℃孵育30 min。孵育結(jié)束后每孔加入100 μL反應(yīng)終止液。用多功能酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定D值。

1.7 胞內(nèi)ATP含量測(cè)定將培養(yǎng)好的菌液用滅菌PBS洗滌、重懸后分成4管,其中3管加入4-萜烯醇,使其終濃度分別為1,4,8 MIC,同時(shí)用PBS設(shè)置陰性對(duì)照。于37℃水浴1 h。4℃離心棄上清,加200 μL裂解液,低溫靜置裂解。4℃離心后轉(zhuǎn)移100 μL上清,低溫保存?zhèn)溆?。按說(shuō)明書(shū)制備標(biāo)準(zhǔn)品,按要求操作消耗ATP背景值,防止其對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。第1列分別加入20 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,其余孔分別加入20 μL處理好的樣品。靜置20 s后用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其D值。

1.8 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌DNA的影響將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA,并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度。取6個(gè)100 μL無(wú)菌離心管,每管加入0.5 μg DNA,然后加入4-萜烯醇,使其與DNA的質(zhì)量比分別為0,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,每管總體積為20 μL。37℃水浴中30 min。將反應(yīng)后的樣品進(jìn)行核酸凝膠電泳,并用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行分析。*P<0.05 表示差異顯著,**P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌最小抑菌濃度通過(guò)刃天青指示劑檢測(cè)4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的MIC,結(jié)果顯示,兩處理組均在第5孔出現(xiàn)了顏色變化,則第4孔的濃度為4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的MIC,即0.016 mol/L(圖1)。

圖1 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的MIC

2.2 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的抑菌曲線為了研究4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的具體抑制時(shí)間和抑制強(qiáng)度,測(cè)定了抑菌曲線。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比, 1 MIC 4-萜烯醇處理組至少在24 h內(nèi)可以完全抑制沙門(mén)菌的生長(zhǎng)(圖2),說(shuō)明4-萜烯醇不僅可以很好的抑制沙門(mén)菌的生長(zhǎng)繁殖,而且其結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,不會(huì)輕易被沙門(mén)菌代謝物降解。

圖2 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的抑菌曲線

2.3 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果由圖3可知,與對(duì)照組菌體相比(圖3A,B),經(jīng)4-萜烯醇作用后的沙門(mén)菌菌體皺縮、菌體表面變得粗糙(圖3C,D)。結(jié)果表明4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的菌體形態(tài)產(chǎn)生了影響。

2.4 核酸與蛋白質(zhì)泄露檢測(cè)如圖4所示,經(jīng)4-萜烯醇處理后,沙門(mén)菌的核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的泄露,1 MIC處理組核酸、蛋白質(zhì)的泄露量隨著4-萜烯醇作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多;4,8 MIC兩個(gè)處理組則是在作用1 h就基本達(dá)到了最大泄露量。這說(shuō)明低濃度4-萜烯醇的作用效果可以隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),且對(duì)沙門(mén)菌的作用效果呈劑量依賴(lài)性。

A,C.PBS處理組;B,D.4-萜烯醇處理組

圖4 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌核酸(A)和蛋白質(zhì)泄露(B)的影響

2.5 ALP含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示,1 MIC處理組的沙門(mén)菌ALP出現(xiàn)泄露,且其泄露程度與陰性對(duì)照組相比呈顯著性差異,4,8 MIC以及陽(yáng)性對(duì)照3個(gè)處理組ALP的泄露程度與陰性對(duì)照組相比呈極顯著性差異。這說(shuō)明4-萜烯醇可以破壞沙門(mén)菌的細(xì)胞壁,造成ALP泄露,且泄露程度與4-萜烯醇的濃度呈正相關(guān)。

2.6 ATP含量測(cè)定ATP 含量測(cè)定結(jié)果如圖6所示,與對(duì)照組相比,1 MIC 4-萜烯醇處理組的沙門(mén)菌胞內(nèi)ATP含量極顯著降低,4,8 MIC 2個(gè)處理組相比于1 MIC處理組其ATP含量下降更加顯著,說(shuō)明沙門(mén)菌的能量機(jī)制損傷隨4-萜烯醇濃度的增大而加重,兩者呈正相關(guān)。

2.7 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌DNA的影響不同濃度4-萜烯醇與沙門(mén)菌DNA作用結(jié)果如圖7所示,處理組DNA條帶的亮度與對(duì)照組相比沒(méi)有發(fā)生降解和拖帶,這說(shuō)明4-萜烯醇不具有降解沙門(mén)菌的DNA的作用,并且也不與沙門(mén)菌的DNA結(jié)合。

圖5 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的ALP泄露的影響

圖6 4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌胞內(nèi)ATP含量的影響

M.DL2000 DNA Marker;1～6.4-萜烯醇和沙門(mén)菌的質(zhì)量比分別為0,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0

3 討論

隨著國(guó)家無(wú)抗綠色健康養(yǎng)殖政策的推廣,開(kāi)發(fā)天然產(chǎn)物抗菌藥物越來(lái)越受到廣泛關(guān)注[9-11]。4-萜烯醇作為多種植物提取物活性成分之一,是一種天然存在的單萜,微溶于水,溶于醇類(lèi)和油類(lèi),因此在試驗(yàn)中常制成水乳劑使用。CORDEIRO等[12]表明,4-萜烯醇與金黃色葡萄球菌的PBP2a蛋白結(jié)合并抑制其活性,PBP2a蛋白的產(chǎn)生是金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)-內(nèi)酰胺廣泛臨床耐藥性的主要機(jī)制。MERTAS等[13]研究表明,4-萜烯醇可增強(qiáng)氟康唑活性,降低其對(duì)白色念珠菌的MIC,將4-萜烯醇等天然物質(zhì)與氟康唑等常規(guī)藥物結(jié)合使用可能有助于治療難治性酵母菌感染。MONDELLO等[14]證明4-萜烯醇在體內(nèi)可以控制白色念珠菌陰道感染。純化后的化合物有望用于治療陰道念珠菌病,尤其是對(duì)氟康唑類(lèi)耐藥的念珠菌病。FERRINI等[15]表明4-萜烯醇對(duì)莫匹羅星、夫西地酸、萬(wàn)古霉素、甲氧西林和利奈唑胺的葡萄球菌耐藥菌株均具有活性,這些表明4-萜烯醇具有良好的抗菌作用。本研究主要探索了4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的作用機(jī)制,最初通過(guò)刃天青試驗(yàn)評(píng)估了4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的MIC,繼而從時(shí)間抑菌曲線結(jié)果看出1 MIC 4-萜烯醇可以在24 h內(nèi)持續(xù)抑制沙門(mén)菌的生長(zhǎng)與繁殖。掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示,經(jīng)4-萜烯醇處理后的沙門(mén)菌的結(jié)構(gòu)變化主要是菌體之間黏連、菌體皺縮。

ALP是一種位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間能將對(duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶,如果細(xì)胞壁遭受損傷,可以從上清液中檢測(cè)ALP[16]。在本研究中,經(jīng)4-萜烯醇處理的沙門(mén)菌上清液中ALP熒光信號(hào)隨4-萜烯醇濃度的增加而增強(qiáng),ALP含量變化可能是由于沙門(mén)菌細(xì)胞壁被破壞導(dǎo)致ALP泄露,并且泄露程度與4-萜烯醇的濃度呈正相關(guān)。核酸和蛋白質(zhì)在1 MIC處理組時(shí)泄露量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多,4,8 MIC 2個(gè)處理組則是在第1小時(shí)達(dá)到最大泄露量。兩種物質(zhì)的泄露趨勢(shì)說(shuō)明在高濃度4-萜烯醇處理下,可能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)沙門(mén)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成嚴(yán)重?fù)p傷,導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)迅速外流,而低濃度的4-萜烯醇則會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐步破壞沙門(mén)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。ATP 作為細(xì)胞內(nèi)重要的能量物質(zhì),經(jīng)常被用于評(píng)價(jià)細(xì)菌或細(xì)胞的能量代謝水平[17-18],其含量大幅度降低更說(shuō)明沙門(mén)菌的正常生理功能遭受到了嚴(yán)重破壞[19]。4,8 MIC 2個(gè)處理組ATP含量極顯著下降也與4,8 MIC 2個(gè)處理組核酸、蛋白質(zhì)短時(shí)間內(nèi)迅速泄露的結(jié)果相呼應(yīng)。沙門(mén)菌胞內(nèi) ATP 含量下降有3種可能:沙門(mén)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性被破壞,導(dǎo)致胞內(nèi) ATP 泄露至上清液中;沙門(mén)菌細(xì)胞通透性增強(qiáng),內(nèi)容物泄露,導(dǎo)致能量合成機(jī)制被損傷,無(wú)法順利合成ATP;沙門(mén)菌應(yīng)激,導(dǎo)致ATP消耗量急劇上升,其合成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于消耗量。至于ATP含量降低的真正原因還需要進(jìn)一步研究。除了已檢測(cè)出的ALP、核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的泄露外,還有可能導(dǎo)致其他物質(zhì)泄露,如鈣離子等電解質(zhì)物質(zhì),繼而導(dǎo)致膜電位出現(xiàn)異常[20]。同時(shí)沙門(mén)菌應(yīng)激過(guò)程中是否會(huì)導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制等還有待深入探索[21]。

本研究表明4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌具有較強(qiáng)的抑菌活性,通過(guò)破壞沙門(mén)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性,使胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、ALP等內(nèi)容物發(fā)生不同程度的泄露,能量物質(zhì)ATP含量無(wú)法維持正常,最終影響沙門(mén)菌的正常代謝,從而無(wú)法正常生長(zhǎng)繁殖。本研究初步探索了4-萜烯醇對(duì)沙門(mén)菌的作用機(jī)制,為后續(xù)開(kāi)發(fā)天然化合物作為抗菌藥物以減緩更多耐藥菌的出現(xiàn)提供了理論基礎(chǔ)。