秦玉明，馮 宇，蔣 卉，彭小薇，許冠龍，朱良全，范學(xué)政，丁家波

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室，北京 102600)

布魯氏菌病(布病)是一種由布魯氏菌引起的慢性多器官損傷性人獸共患傳染病，我國將其列為二類動物疫病[1]。我國是畜牧業(yè)大國，牛羊豬等家畜的飼養(yǎng)量位居世界首位。在給人民群眾提供豐富肉蛋奶等動物產(chǎn)品的同時，也給動物疫病防控帶來巨大挑戰(zhàn)。近十年來，我國畜間和人間布病感染率居高不下，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生事業(yè)，防控布病迫在眉睫。在布病流行的國家和地區(qū)，使用疫苗是一種必不可少且行之有效的方法。

目前我國生產(chǎn)的布病活疫苗主要有S2株、M5株/M5-90株、A19株和2020年注冊通過的A19-ΔVirB12株。2016年，四川省一家獸用生物制品企業(yè)發(fā)生個別生產(chǎn)人員感染布魯氏菌事件[2]。2019年甘肅省蘭州市布病抗體陽性聚集事件表明，獸用的布病弱毒活疫苗(S2株)雖然感染人的風(fēng)險較低，但在防控不到位和特殊環(huán)境條件下，仍會對生產(chǎn)疫苗的操作工人產(chǎn)生感染風(fēng)險，威脅直接接觸人員的身體健康。因此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2020年1月發(fā)布《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于切實加強獸用布氏菌病活疫苗生產(chǎn)安全監(jiān)管工作的通知》[3]，要求布病活疫苗生產(chǎn)企業(yè)加強管理，尤其需要對生產(chǎn)布病活疫苗的生產(chǎn)操作區(qū)域(廠房與設(shè)施、菌種繁殖及發(fā)酵培養(yǎng)、配苗與分裝、凍干、軋蓋、貼簽與包裝)使用的專用設(shè)備以及在生產(chǎn)與檢驗及其設(shè)備維護(hù)過程中存在的生物安全風(fēng)險進(jìn)行識別與評估，并在風(fēng)險評估基礎(chǔ)上需要采用有效的措施進(jìn)行控制。在2020年4月頒布的新版《獸藥GMP規(guī)范》及隨后發(fā)布的《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第292號》明確了新版《獸藥GMP規(guī)范》中生物制品的相關(guān)要求[4-5]，對生產(chǎn)布病活疫苗企業(yè)的質(zhì)量管理、廠房與設(shè)施、生產(chǎn)管理、驗證與確認(rèn)等進(jìn)行規(guī)范。

本文對動物布病活疫苗的生產(chǎn)、檢驗、個人防護(hù)及環(huán)境監(jiān)測管理等各環(huán)節(jié)中存在的主要生物風(fēng)險進(jìn)行識別，對易被忽視的主要生物安全風(fēng)險點進(jìn)行分析，并就如何加強生物安全風(fēng)險防控進(jìn)行論述，供獸藥生產(chǎn)企業(yè)及地方藥政管理部門監(jiān)督檢查時參考。

1 主要生物安全風(fēng)險點

1.1 硬件設(shè)備與設(shè)施

1.1.1 發(fā)酵罐 布魯氏菌活疫苗的生產(chǎn)首先需要通過發(fā)酵罐采取通氣培養(yǎng)方式實現(xiàn)擴大繁殖。因此，發(fā)酵罐是布病活疫苗生產(chǎn)最為重要和生物安全風(fēng)險最大的生產(chǎn)設(shè)備之一。在布魯氏菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中需要輸入氧氣和二氧化碳，同時還會產(chǎn)生廢氣。發(fā)酵罐內(nèi)的菌液在不斷攪拌過程中產(chǎn)生大量含有布魯氏菌的氣溶膠，會隨著廢氣排出發(fā)酵罐外。發(fā)酵結(jié)束后，在對發(fā)酵罐進(jìn)行在線原位滅菌(SIP)和在線清洗(CIP)中忽視對呼吸器滅菌效果驗證，也存在一定風(fēng)險。

1.1.2 密閉的分裝、加塞、軋蓋聯(lián)動裝置 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后的菌液經(jīng)沉淀濃縮處理后就進(jìn)行配苗與分裝。布病活疫苗的分裝、加塞、軋蓋過程中除了要考慮避免環(huán)境中的微生物污染產(chǎn)品外，還要考慮分裝過程中因敞口或者非密閉操作過程中產(chǎn)生的氣溶膠給相關(guān)生產(chǎn)人員帶來的感染風(fēng)險。在軋蓋過程中極少量壓碎、壓裂的疫苗瓶也會外包裝生產(chǎn)區(qū)散播大量布魯氏菌，在普通的開放的正壓環(huán)境下，也給操作人員帶來一定的生物安全風(fēng)險。

1.1.3 凍干機 弱毒活疫苗需要經(jīng)過凍干機的冷凍干燥過程。真空泵在冷凍干燥過程，疫苗瓶中升華的水蒸氣必然攜帶存活的布魯氏菌，直接排放就是對大氣環(huán)境散毒。在凍干結(jié)束后，疫苗瓶外壁也會存留少量分裝或者凍干過程中外溢到瓶壁上的布魯氏菌，給隨后軋蓋、貼內(nèi)標(biāo)簽的操作人員帶來感染風(fēng)險。

1.1.4 高效過濾器 根據(jù)2020年版《獸藥GMP規(guī)范》和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關(guān)規(guī)定，生產(chǎn)布病活疫苗車間涉及活菌的負(fù)壓環(huán)境，需在排風(fēng)口安裝高效過濾器。高效過濾器性能好壞直接關(guān)系到車間內(nèi)活菌排放風(fēng)險。決定高效過濾器性能的主要是過濾效率和過濾阻力[6]。一旦其過濾效能未驗證，或未及時發(fā)現(xiàn)濾膜破損，則可能直接向環(huán)境散毒。

1.1.5 活毒廢水滅活罐 涉及活菌操作產(chǎn)生的廢水都需要收集到密閉罐內(nèi)進(jìn)行無害化處理。在處理過程中如果滅菌溫度不夠，或者滅菌溫度沒有維持到規(guī)定的滅活時間，或者在罐體上的溫度壓力等儀表出現(xiàn)數(shù)據(jù)漂移導(dǎo)致顯示不準(zhǔn)確，都有可能出現(xiàn)滅活不徹底造成散毒風(fēng)險。

1.1.6 生物安全柜 布魯氏菌從擴繁菌種到半成品及成品檢驗都需要使用生物安全柜。一般，成品活菌計數(shù)都會在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。一旦企業(yè)為生產(chǎn)方便，將疫苗種子逐級擴繁和半成品檢驗就在車間內(nèi)的超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，就會對操作人員帶來暴露風(fēng)險。此外，生物安全柜沒有進(jìn)行定期校驗、沉降菌、風(fēng)速等檢測，其也無法確定對操作人員起到保護(hù)作用。

1.1.7 負(fù)壓獨立隔離器(IVC) 一般弱毒活疫苗的安全檢驗僅需要正壓環(huán)境即可進(jìn)行，但布病活疫苗成品安全檢驗必須使用負(fù)壓的獨立通風(fēng)隔離器(IVC)。否則，小鼠體內(nèi)增殖的布魯氏菌可能隨著糞便或者尿液排到IVC鼠籠內(nèi)，隨著空氣排到環(huán)境中，對室內(nèi)檢驗人員帶來生物安全風(fēng)險。安全檢驗結(jié)束后，如果沒有先將IVC鼠籠原位消毒就移到清潔區(qū)外進(jìn)行清洗和滅菌，也會散毒并造成清洗人員感染風(fēng)險。

1.1.8 正壓呼吸頭套、N95口罩、眼罩等個人防護(hù)設(shè)備(PPE) 在涉及到活菌菌種擴繁、發(fā)酵擴大培養(yǎng)、分裝與軋蓋、半成品檢驗、成品檢驗或者車間設(shè)備維護(hù)維修過程中，相關(guān)的操作人員都有可能遇到存留的或者意外溢出的少量布魯氏菌。如果沒有根據(jù)操作工序風(fēng)險大小選擇佩戴正壓呼吸頭套、N95口罩、眼罩等適宜的個人防護(hù)設(shè)備(PPE)，就可能造成人員感染風(fēng)險。在重復(fù)使用正壓呼吸頭套或者其他防護(hù)設(shè)施后，一旦消毒效果不確實，也存在交叉感染的風(fēng)險。

1.2 生產(chǎn)過程

1.2.1 生產(chǎn)工藝確認(rèn)與變更 企業(yè)需要以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部注冊批準(zhǔn)的工藝規(guī)程制定適合自身的布病活疫苗工藝規(guī)程。該工藝規(guī)程一經(jīng)審批就不能隨意變更，輕易變更其中的任何一項關(guān)鍵參數(shù)，都會對整個產(chǎn)品帶來不確定性。比如，更換新滅菌設(shè)備，按照原有參數(shù)可能導(dǎo)致滅菌效果不徹底；改變培養(yǎng)發(fā)酵一些參數(shù)，導(dǎo)致細(xì)菌生長曲線變動；改變培養(yǎng)方式，對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不確定性風(fēng)險。

1.2.2 有菌區(qū)潔凈級別的控制 布病活疫苗在涉及到開口暴露的分裝、凍干、加塞等生產(chǎn)過程中，很可能污染外源病微生物。因此，對相應(yīng)的生產(chǎn)環(huán)境的潔凈界別要進(jìn)行嚴(yán)格控制，防止產(chǎn)品污染環(huán)境中微生物，造成疫苗產(chǎn)品本身的安全性風(fēng)險。

1.2.3 清潔滅菌方法驗證消毒劑配制及更換 在布病疫苗整個生產(chǎn)、檢驗、設(shè)備檢修及廢棄物無害化處理過程中，都涉及到對病原微生物的滅菌處理。發(fā)酵罐滅菌溫度維持不夠，或者活毒廢水滅活操作不合理，就會造成向環(huán)境散毒風(fēng)險；日常清潔消毒擦拭的消毒液選擇或者配制不對[7-8]，就無法實現(xiàn)對殘留的病原菌的殺滅作用。

1.3 人員

1.3.1 相關(guān)人員生物安全知識培訓(xùn)及效果評價 布病活疫苗在生產(chǎn)、檢驗甚至設(shè)備維護(hù)與檢修人員都有可能在工作中接觸到布魯氏菌活菌。尤其是布魯氏菌疫苗株種子批制備人員、發(fā)酵罐操作人員，分裝、軋蓋與凍干人員，半成品與成品活菌計數(shù)、成品安全檢驗、高效過濾器更換與維修人員，如果未經(jīng)崗位培訓(xùn)，或者培訓(xùn)效果不好，在正常工作中就會有感染風(fēng)險。

1.3.2 突發(fā)泄露事件的演練及環(huán)境監(jiān)測 前面都是正常生產(chǎn)、檢驗、或者維修時可能遇到的暴露風(fēng)險，但實際生產(chǎn)過程中難免會遇到意外發(fā)生。比如隔離服在操作中意外破損，正壓呼吸頭套故障，貼標(biāo)簽發(fā)現(xiàn)破損疫苗瓶，高效過濾器泄露，負(fù)壓車間出現(xiàn)正壓情況，生物安全柜風(fēng)速異常等等，都會對操作人員產(chǎn)生暴露風(fēng)險。

2 應(yīng)對措施

2.1 加強對涉及活菌操作中主要設(shè)備風(fēng)險點的管控

2.1.1 加強對發(fā)酵罐的管理 對于發(fā)酵罐設(shè)置疏水型的呼吸閥并將排出氣體嚴(yán)格進(jìn)行無害化處理。在發(fā)酵后期，伴隨氧氣和二氧化碳?xì)怏w的輸入及攪拌噴出的氣溶膠，需采取有效的氣體與液體分離技術(shù)，分別進(jìn)行滅菌或者除菌措施。發(fā)酵結(jié)束后對罐體進(jìn)行徹底的消毒滅菌時，要嚴(yán)格執(zhí)行原位在線滅菌和在線清潔的操作規(guī)程，保護(hù)車間內(nèi)人員免于布魯氏菌暴露感染風(fēng)險。

2.1.2 采用分裝、加塞、軋蓋密封隔離系統(tǒng) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2020年版《獸藥GMP規(guī)范》中明確規(guī)定[4]，布病疫苗配制與分裝等過程中要采用隔離操作技術(shù)，在密閉的系統(tǒng)進(jìn)行活菌操作。因此，企業(yè)應(yīng)該采用處于負(fù)壓環(huán)境下的密封全自動灌、軋、消聯(lián)動的生產(chǎn)設(shè)施，既保證產(chǎn)品不會被環(huán)境微生物污染，也可以防止疫苗在配制、分裝、軋蓋等過程中產(chǎn)生的氣溶膠感染操作人員。

2.1.3 重視凍干機的管控 為防止凍干過程中將布魯氏菌排放到大氣中，必須將凍干機排放升華的水蒸氣進(jìn)行無害化處理后才能排放到大氣環(huán)境中。在凍干結(jié)束后，還需要對凍干機箱體內(nèi)的疫苗瓶外表面進(jìn)行消毒，以防止外溢的少量殘留的布魯氏菌在貼內(nèi)標(biāo)簽過程中帶給操作人員的感染風(fēng)險。現(xiàn)在，布病活疫苗在凍干結(jié)束出箱前會通過氧化氫、臭氧等氣體進(jìn)行熏蒸或者噴灑不易揮發(fā)的對布魯氏菌非常敏感的消毒液進(jìn)行滅菌。這就需要驗證熏蒸消毒對布病活疫苗保存期的影響。

2.1.4 尤其要重視排風(fēng)口高效過濾器維護(hù) 在排風(fēng)口的高效過濾器安裝阻力監(jiān)測儀就可以實現(xiàn)對檢漏實時監(jiān)測，防止生產(chǎn)過程中泄露的微生物污染大氣環(huán)境。企業(yè)還要評估制定高效過濾器的更換制度，以避免生產(chǎn)過程中泄露概率的發(fā)生。在排風(fēng)口采用專用的袋進(jìn)袋出過濾箱(BIBO)，也可以避免更換時箱體內(nèi)氣體與外界接觸，BIBO過濾箱上配有手套，還方便工作人員安全操作。

2.1.5 注意生物安全柜、負(fù)壓的獨立通風(fēng)隔離器(IVC)、活毒廢水滅活罐等重要設(shè)備的驗證或者校驗對布病活疫苗生產(chǎn)、檢驗中使用的生物安全柜、獨立通過隔離器以及活毒廢水滅活罐的無害化處理等都需要進(jìn)行驗證或者校驗。一般，生物安全柜1年校驗一次，使用中隨時注意吸入風(fēng)速與垂直風(fēng)速。必須使用負(fù)壓獨立通風(fēng)隔離器(IVC)，確保檢驗人員的安全。對IVC鼠籠原位消毒后，才能移動到清潔區(qū)外。確認(rèn)對滅活罐體內(nèi)維持的溫度及其持續(xù)時間，對溫度表及其壓力計進(jìn)行定期驗證，確保其滅菌效果。

2.1.6 注意正壓呼吸頭套等個人防護(hù)設(shè)備的正確使用與維護(hù) 根據(jù)布魯氏菌感染人員的途徑與感染形式的不同，在整個生產(chǎn)、檢驗等涉及活菌操作的人員防護(hù)中就需要針對性做好個人防護(hù)。在涉及到大量布魯氏菌的繁殖、分裝過程中，生產(chǎn)車間內(nèi)的工作人員應(yīng)該佩戴正壓呼吸頭套，結(jié)束后應(yīng)及時對正壓呼吸頭套進(jìn)行消毒以防止交叉污染。一般常用的0.2%苯扎溴銨溶液、0.1%聚維酮碘溶液、戊二醛、癸甲溴銨、0.1%聚維酮碘溶液[7-8]或者75%酒精溶液滅菌效果較好。此外，最好能將正壓呼吸頭套置入密閉熏蒸柜內(nèi)熏蒸消毒，以徹底殺滅內(nèi)外表面殘留的微量病原微生物。

2.2 加強對生產(chǎn)工藝、關(guān)鍵參數(shù)的控制及消毒滅菌的驗證

2.2.1 加強對生產(chǎn)工藝審批備案等管理，對關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行驗證 2020年版《獸藥GMP規(guī)范》規(guī)定[4]，企業(yè)自己經(jīng)過驗證后制定的布病活疫苗生產(chǎn)工藝一旦審批通過，就不能輕易變更。如需變更，必須經(jīng)過驗證和生物安全風(fēng)險評估，證明其對產(chǎn)品質(zhì)量不會產(chǎn)生不良影響，且不會產(chǎn)生生物安全風(fēng)險，將變更后的工藝到原審批單位進(jìn)行備案。因此，布病活疫苗生產(chǎn)企業(yè)一定嚴(yán)格按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部審批的生產(chǎn)工藝規(guī)程[9-10]制定經(jīng)過自己驗證的生產(chǎn)工藝，并嚴(yán)格按照申報審批的工藝規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)與檢驗。

2.2.2 做好潔凈區(qū)域潔凈級別的監(jiān)測 2020年版《獸藥GMP規(guī)范》規(guī)定應(yīng)該對無菌生產(chǎn)過程進(jìn)行動態(tài)檢測，可以采用測定沉降菌和浮游菌的方式進(jìn)行。一旦超標(biāo)，就要對分離培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行是否為布魯氏菌鑒定，以及時發(fā)現(xiàn)生物安全風(fēng)險，降低人員感染風(fēng)險。由于單個沉降平皿需要暴露4 h[5]，普通的培養(yǎng)基常因表面干裂影響分離效果，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。為此，也可以采用同一位置使用多個平皿連續(xù)進(jìn)行監(jiān)測并累積計數(shù)的方法進(jìn)行檢測。對于操作活菌區(qū)域的人員還要進(jìn)行隔離服及手套等部位擦拭檢測含菌量，以驗證車間動態(tài)潔凈級別。

2.2.3 消毒及驗證工作 消毒及消毒效果驗證主要根據(jù)布魯氏菌的生物學(xué)特性及其對物理、化學(xué)等因素的抵抗力決定。根據(jù)布魯氏菌對濕熱的敏感性選擇濕熱滅菌對發(fā)酵罐進(jìn)行消毒，采用高壓滅菌對重復(fù)使用的衣物及耐高壓的物品進(jìn)行滅菌處理，采用擦拭消毒劑對操作臺面進(jìn)行消毒處理，采用氣體熏蒸對密閉空間內(nèi)滅菌消毒。不同消毒滅菌的方法也需要采用適宜的驗證方法，對環(huán)境溫度、溶液溫度、消毒劑濃度/霧滴大小、作用時間、壓力等重要參數(shù)對最終消毒效果的影響因素。

2.3 加強對相關(guān)人員的培訓(xùn)及應(yīng)急演練 布魯氏菌主要傳染途徑為消化道、眼結(jié)膜、破損的皮膚、呼吸道等途徑[11]。所以，布病疫苗生產(chǎn)、檢驗及設(shè)施維護(hù)的人員要經(jīng)過必要的專業(yè)知識培訓(xùn)，重點對正壓呼吸頭套、乳膠手套、N95口罩等個人防護(hù)設(shè)備設(shè)施正確使用的培訓(xùn)以及正確配制消毒液與正確消毒操作及的培訓(xùn)。對密閉空間消毒時人員防護(hù)，布魯氏菌泄露或者操作活菌人員出現(xiàn)利器刺傷時應(yīng)急演練應(yīng)該成為檢驗培訓(xùn)效果常態(tài)。

3 結(jié) 語

本文僅就布病疫苗生產(chǎn)、檢驗、維護(hù)中主要的生物安全風(fēng)險點進(jìn)行分析與梳理。在整個布病活疫苗生產(chǎn)過程中還有很多其他的風(fēng)險點往往容易被大家忽視。因此，需要不斷提高認(rèn)識，杜絕在布病疫苗生產(chǎn)、檢驗中出現(xiàn)的泄露誤判或者漏檢等風(fēng)險。

就布病疫苗生產(chǎn)企業(yè)而言，還需要對生產(chǎn)車間內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行檢測。在車間內(nèi)，同時動態(tài)檢測沉降菌[12]、浮游菌[13]、懸浮粒子[14]。在車間外，定期在周邊樹葉、地面等環(huán)境采樣，分析散毒風(fēng)險，并對相關(guān)人員進(jìn)行抗體檢測。根據(jù)2020年版《獸藥GMP規(guī)范》附錄3[5]第15條和第24條的規(guī)定，布病疫苗生產(chǎn)區(qū)域可以根據(jù)風(fēng)險評估的結(jié)果采用絕對負(fù)壓或者相對負(fù)壓，以確保生物安全風(fēng)險。實際上，對車間生產(chǎn)狀態(tài)下進(jìn)行負(fù)壓控制受很多因素影響[15]，比如在開門與閉門，不同區(qū)域功能壓力波動瞬間干擾，送排風(fēng)機機啟動與關(guān)閉造成氣流分配紊亂等也會存在一定影響，需要對變頻調(diào)節(jié)風(fēng)速與風(fēng)量系統(tǒng)進(jìn)行驗證與風(fēng)險評估。

隨著我國的布病疫苗生產(chǎn)企業(yè)的生物安全風(fēng)險認(rèn)識及控制水平不斷提升，布病疫苗的質(zhì)量管理水平必然得到進(jìn)一步的提高。只有不斷加強布病活疫苗生產(chǎn)工藝重要參數(shù)的驗證，對生產(chǎn)檢驗各個環(huán)節(jié)制定詳細(xì)的操作規(guī)程及其風(fēng)險防控預(yù)案，才能持續(xù)提升獸藥生產(chǎn)企業(yè)生物安全管控能力。