馮志新

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京210014)

絕大多數(shù)的病原體均是利用呼吸道黏膜作為進入體內(nèi)的入口，因此，呼吸道病毒和細菌的感染是世界范圍內(nèi)人類及動物發(fā)病和死亡的主要原因[1,2]。疫苗免疫是預防傳染病的主要策略。氣溶膠免疫是一種潛在的替代傳統(tǒng)注射免疫的新方法。整個氣道與肺中含有大量的抗原提呈細胞和支氣管相關淋巴組織，有利于誘導體液免疫與細胞免疫。將疫苗制備成氣溶膠形態(tài)，通過模擬自然感染來誘導免疫，可能是一種潛在的強有力的快速免疫接種方法。但要將疫苗制備成氣溶膠形態(tài)，并通過吸入方式輸送疫苗顆粒，有許多因素需要考慮，包括氣溶膠的發(fā)生方式、免疫方式、影響因素等。本文將圍繞疫苗氣溶膠疫苗免疫技術的研究進展作以綜述。

1 氣溶膠的基本概述

氣溶膠是以固態(tài)或液態(tài)的微?；蛭⒌螢榉稚⑾?，均勻分散懸浮于空氣中，以空氣為分散介質(zhì)所形成的膠態(tài)分散系統(tǒng)。氣溶膠中微?；蛭⒌蔚目諝鈩恿W粒徑通常在0.01～100 μm之間，其大多在10 μm以下。根據(jù)氣溶膠中顆粒物的物理狀態(tài)不同，可將氣溶膠分為三類：(1)固態(tài)氣溶膠，如煙和塵；(2)液態(tài)氣溶膠，如霧；(3)固液混合態(tài)氣溶膠，如煙霧和霾。對于氣溶膠的研究已滲入到人類生活的許多領域，如工業(yè)氣溶膠、農(nóng)業(yè)氣溶膠、氣象氣溶膠、運輸業(yè)氣溶膠、放射性氣溶膠、微生物氣溶膠等。本文綜述的氣溶膠免疫重點圍繞微生物氣溶膠進行討論。

2 微生物氣溶膠感染

微生物氣溶膠是一群形體微小、構(gòu)造簡單的單細胞或接近單細胞的生物懸浮于空氣中所成形的膠體體系。簡單地說，指含有病毒或細菌等微生物的氣溶膠，按其形成組分可分為病毒氣溶膠、細菌氣溶膠和真菌氣溶膠。大多數(shù)微生物氣溶膠具有傳染性，通過飛沫、飛沫核和塵埃的方式，經(jīng)空氣傳播，導致傳染病的發(fā)生。通過氣溶膠傳播感染的疾病很多，人類疾病如流感、腮腺炎、麻疹、結(jié)核、新型冠狀病毒肺炎等；動物疾病如豬瘟、豬丹毒、偽狂犬病、巴氏桿菌病、豬流感、豬支原體肺炎、口蹄疫、牛肺疫、犬瘟熱、禽痘、雞新城疫、雞傳染性喉氣管炎等。但不同的病原微生物在氣溶膠中的生存能力及傳播能力存在較大的差異，如H1N1流感病毒可通過空氣傳播至少10米[3]，豬肺炎支原體在空氣中擴散4.7公里仍具感染性[4-5]?？谔阋卟《驹诳諝庵须S風傳播存活的最長距離可達60～100公里[6]。因此，對于微生物氣溶膠的研究，首先聚焦于疾病的感染模型，如結(jié)核、布病、炭疽等許多疾病已采用氣溶膠暴露給動物的方法來模擬自然感染，從而建立動物發(fā)病模型[7-10]。而對于微生物氣溶膠免疫雖然與感染特征相近，但研究角度與機理不盡相同。

3 氣溶膠免疫的機理

微生物通過氣溶膠感染時，首先在呼吸道局部繁殖, 然后再擴散至全身。因此, 局部黏膜有無免疫力對于抗感染是相當重要的。局部免疫力包括局部分泌性抗體(SIgA，即分泌性免疫球蛋白A為主)和局部免疫活性細胞兩個方面，局部黏膜的免疫力可直接殺死入侵的微生物，阻止其繁殖, 防止感染。微生物氣溶膠免疫的重要機理就表現(xiàn)在這一點。動物實驗證明, 微生物氣溶膠免疫主要涉及頭部、氣管旁、咽喉后壁、肺門、縱隔等處的局部淋巴結(jié)，重點誘導氣道中鼻相關淋巴組織(NALT)和支氣管相關淋巴組織(BALT)。它可以非選擇性地傳遞細菌、病毒的抗原給巨噬細胞和樹突狀細胞，由這些細胞提呈抗原，并進一步產(chǎn)生免疫應答：產(chǎn)生特異性淋巴因子、調(diào)控B細胞的分化、合成和分泌SIgA，從而在黏膜表面形成一層免疫保護層，既可抑制細菌、病毒粘附于黏膜上皮，還可中和黏膜上皮內(nèi)的病毒，具有顯著的抗菌抗病毒作用；另外，氣溶膠免疫在黏膜的局部免疫反應中，還能誘導產(chǎn)生細胞免疫應答，例如對抗原成分應答的CD8+細胞毒性淋巴細胞(CTL)，能產(chǎn)生巨噬細胞激活因子及殺傷細胞內(nèi)病原體的細胞因子等，并且通過呼吸道免疫接種可產(chǎn)生肺記憶T細胞，這些肺駐留T細胞的表型與外周血中的T細胞不同，它們對呼吸道病原的反應更強烈，從而對維持抗原刺激和第二次免疫應答中起重要的作用，提供了額外的感染保護[11-12]。同時，當進行氣溶膠免疫時，5 μm以下的氣溶膠抗原顆?？呻S著呼吸運動沉積到細支氣管和肺泡表面，成人的肺泡約有3億個, 其表面積約為30平方米，而且肺泡壁上有長達2000公里的毛細血管網(wǎng)，疫苗抗原可以很快進入血液，激活全身的系統(tǒng)免疫，而且由于疫苗抗原的接觸面積大、時間長、吸收率高，免疫刺激性也必然增強，機體的防護反應也得以加強。因此簡單來說，疫苗以氣溶膠形式進入體內(nèi)后，一方面在呼吸道黏膜局部刺激吞噬細胞分化漿細胞，產(chǎn)生局部抗體和干擾素的作用，增強呼吸道黏膜的保護力；另一方面被吞噬細胞吞噬后轉(zhuǎn)運到淋巴器官或血液，產(chǎn)生全身體液免疫。而常規(guī)的肌肉注射免疫，主要是形成全身體液免疫(主要為免疫球蛋白G)，只有在病原微生物繁殖進入血液循環(huán)后，才能將其中和或消滅，所以只能在感染后起到控制發(fā)展和縮短病程的作用。為此，人們認為氣溶膠免疫途徑優(yōu)于其他免疫途徑。

另外，由于禽類與哺乳動物均存在共同黏膜免疫系統(tǒng)(CMIS)[13-14]。呼吸道免疫后，機體針對同一抗原致敏的部分淋巴細胞可以回流到胃腸道、生殖道等多個效應部位SIgA，發(fā)揮特異性免疫反應[15-16]。因此，呼吸道氣溶膠免疫后可對消化道或生殖道的病原感染產(chǎn)生一定的免疫保護。

4 氣溶膠免疫的方法

氣溶膠免疫與鼻腔免疫均屬于呼吸道免疫，但由于兩者免疫后疫苗抗原的分布位置不同。鼻腔免疫對疫苗液滴的大小要求不高，疫苗抗原主要分布在鼻道。氣溶膠免疫則需要通過特殊的氣溶膠發(fā)生裝置將疫苗分散成10微米以下液相或固相的氣溶膠形態(tài)，隨著接種者的呼吸運動，疫苗抗原被輸送到從鼻道、氣管、支氣管甚至肺泡等部位，覆蓋整個呼吸道。因此氣溶膠免疫相比鼻腔免疫，在免疫設備、免疫方法與免疫參數(shù)方面均存在特殊的要求。

在免疫設備方面，根據(jù)霧化發(fā)生的原理以及氣溶膠顆粒大小的不同，已有多個裝置或設備用于氣溶膠疫苗的發(fā)生。通常來說，氣溶膠發(fā)生裝置主要分為三類：液相霧化器、計量式吸入器和干粉吸入器(表1)。目前用于人類與動物疫苗霧化免疫的裝置主要采用液相霧化器和干粉吸入器。其中商業(yè)化使用的液相霧化器按氣溶膠發(fā)生方式又可分為空氣噴射式霧化器和超聲波霧化器兩種?？諝鈬娚涫届F化器常用于疫苗的霧化免疫，如德國的Pari系列霧化器、加拿大的Aero Eclipse霧化器(Trudell Medical International)、英國的Halolite霧化器(Medic-Aid Limited)等。但由于鼠類、鳥類和哺乳動物不僅存在種間差異，在呼吸系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)方面也存在明顯差異，從而導致生物轉(zhuǎn)化率、呼吸模式和組織分布的差異[17]。因此，用于氣溶膠免疫的霧化發(fā)生裝置必須針對特定種屬動物專門設計[18]。國內(nèi)軍事醫(yī)學科學院將空氣噴射式霧化器DV40與控制系統(tǒng)結(jié)合，設計了可對實驗過程實時監(jiān)測的鼠類動物氣溶膠吸入暴露裝置[19]。筆者根據(jù)畜禽養(yǎng)殖現(xiàn)場條件與自動化免疫的需求，設計了適用于豬群體免疫的系列液相霧化設施與裝置[20-23]。

表1 氣溶膠發(fā)生裝置比較Tab1 Comparison of aerosol vaccine or drug delivery devices

在免疫方法方面，人用疫苗主要聚焦于麻疹、結(jié)核和流感疫苗的氣溶膠免疫測試。其中一種可吸入的麻疹干粉疫苗已完成了一期臨床，并證實安全性和高水平抗體的產(chǎn)生[25]。對于家禽，由于它們較小的體型和通過肺部的單向氣流，有利于氣溶膠疫苗在呼吸道的沉積，加上家禽養(yǎng)殖密度大、禽籠設施較小，實施氣溶膠免疫更具可行性。但事實上，對家禽的呼吸道免疫常采用噴霧接種的標準，這里的噴霧接種指的是1～200微米的液體顆粒，這種液體顆粒并不專門用于吸入，同時也能通過眼、口和鼻黏膜誘導免疫。與雞的噴霧免疫不同，豬用疫苗主要嘗試氣溶膠免疫，如胸膜肺炎放線桿菌[26]、豬瘟疫苗[27]、豬流感疫苗[28]和豬支原體肺炎活疫苗[29]，且以空氣噴射式霧化器免疫為主，但目前均在試驗階段，尚無商業(yè)化的豬用氣溶膠疫苗。

在免疫參數(shù)方面，由于個體呼吸速率的變化、免疫期間疫苗的損失以及實際沉積到肺部疫苗的數(shù)量，都可能導致誘導的免疫反應具有較高的變動性[30]，因此，在氣溶膠免疫前需要對疫苗的免疫劑量進行測算。加拿大學者根據(jù)氣溶膠疫苗的輸出量、粒徑分布、免疫人群的呼吸參數(shù)(潮氣量、呼吸頻率)等在體外預估了成人與兒童霧化接種麻疹疫苗的免疫劑量[31]。我國在60年代也根據(jù)免疫個體的潮氣量、個體數(shù)量、免疫空間容積以及氣溶膠疫苗單位輸出量等因素建立了幾個醫(yī)學氣溶膠的計算方法，有的是適應邊噴邊吸模式，也有的是適合先噴后吸模式[32]。但是對于氣溶膠免疫劑量的科學計算決非僅在于其計算方法或計算公式，還涉及到對氣溶膠發(fā)生與存在過程中的很多影響因素。

5 氣溶膠免疫的影響因素

氣溶膠疫苗顆粒的大小是影響氣溶膠免疫成敗的首要因素。成功的氣溶膠免疫首先需要將疫苗抗原顆粒輸送到合適的靶組織。霧化顆粒在人和動物呼吸道中的沉降位置和沉降效率受其粒徑(空氣動力學參數(shù))、粒徑分布、顆粒形狀和密度等因素的影響[33]。對于人的呼吸道，1～5 μm氣溶膠顆?？梢缘竭_細支氣管和肺泡，然而>10 μm的顆粒只能存在于上呼吸道鼻腔[34-35]。雞的呼吸道相對短且直，另配有氣囊結(jié)構(gòu)，對于不同粒徑氣溶膠顆粒的沉積沒有絕對的范圍限定，且1日齡雞由于存在口腔呼吸，會出現(xiàn)大顆粒進入下呼吸道的現(xiàn)象，但總體而言，大于5 μm的顆粒也較難進入肺和肺泡[36]。豬的呼吸道解剖結(jié)構(gòu)又具有特殊性，但可以參考氣溶膠顆粒在人呼吸道的沉積相關性[29]。氣溶膠疫苗在呼吸道沉積的位置也影響了宿主的免疫應答與保護，因此氣溶膠免疫不僅是要將疫苗抗原輸送進呼吸道，更重要的是取決于目標病原體和誘導免疫的部位。如流感疫苗沉積到氣管/支氣管或肺泡深部均可誘導較強的免疫保護。然而，對于乙肝疫苗而言，沉積在氣管/支氣管并不能產(chǎn)生免疫保護，而在肺泡深部沉積后免疫保護反應卻相當明顯[37]。一般來說，對于預防百日咳博德特氏菌和肺炎衣原體等上呼吸道感染的病毒或細菌需要更大的粒子(> 5 μm)的疫苗，而對于肺炎鏈球菌、炭疽桿菌等下呼吸道感染的病原則需要小于3 μm的微粒[38]。氣溶膠疫苗顆粒的粒徑與粒度分布，不僅與疫苗液滴的表面張力、粘度及飽和蒸汽壓相關，而且也受不同的霧化方式以及霧化環(huán)境中溫濕度的影響[39]。

另外，氣溶膠免疫還需保持疫苗抗原的活性，以保證有效免疫應答的產(chǎn)生。對氣溶膠疫苗活性和抗原性的影響來自于整個霧化過程的不同階段。霧化早期，主要由霧化作用產(chǎn)生的熱量、機械和剪切應力，可以快速地降解疫苗蛋白，使其失活。當氣溶膠發(fā)生后，主要來自于環(huán)境壓力，包括高鹽、干燥和紫外線輻射等[40-41]。微生物氣溶膠顆粒的大小也影響氣溶膠疫苗的活性，更大的顆粒含有更多的細菌聚集在一起，外層的細菌在氣溶膠化過程中犧牲，使內(nèi)層的細菌得以存活[41-42]。

免疫個體的宿主因素同樣是影響氣溶膠免疫成敗的關鍵。制備粒徑大小合適的氣溶膠疫苗可以將疫苗抗原沉積到動物呼吸道內(nèi)合適的部位，但仍必須逃避呼吸道的各種防御機制，如黏液、纖毛運動、黏膜抗體、酶類或其他抗菌物質(zhì)，才能使疫苗抗原靶向接種到呼吸道黏膜表面或上皮組織。因此，氣溶膠疫苗接種不僅需要更高劑量的抗原，還需要保證疫苗抗原靶向黏膜組織的遞送系統(tǒng)，如減毒活病毒與活細菌載體、共生細菌載體、病毒樣顆粒、脂質(zhì)體、脂肽、免疫刺激復合物、微球、納米顆粒和樹突狀細胞等[43-44]。另外，適合的黏膜佐劑可以顯著提高氣溶膠疫苗免疫后的免疫應答能力或增加抗原在靶組織中的停留時間，延長抗原被提呈細胞吸收的機會。已有一些具有潛質(zhì)的佐劑，如細菌毒素及其衍生物、細菌DNA基序、細胞因子、趨化因子、納米乳液和天然聚合物在呼吸道進行嘗試[34,45,46]。除了黏膜的防御機制以外，從消化道免疫來看，黏膜上常在微生物群對疫苗的免疫也可能產(chǎn)生影響[47]，雖然全基因組測序結(jié)果表明，呼吸道同樣存在微生物群[48]，但其對氣溶膠疫苗的免疫是否存在影響尚不清楚。

6 氣溶膠免疫的應用情況與前景

氣溶膠免疫技術已在人類及多種畜禽疫苗的接種上研究或應用。自20世紀50年代雞新城疫氣霧劑疫苗的研制拉開了動物呼吸道免疫的序幕[49]，隨后開展的是雞傳染性支氣管炎疫苗的噴霧接種[50]，目前均已被廣泛使用。上世紀70年代末，我國將口蹄疫活疫苗、牛巴氏桿菌活疫苗、布魯氏菌病活疫苗、羊敗血性鏈球菌活疫苗等分別在牦牛和綿羊上進行聯(lián)合氣霧免疫研究，表現(xiàn)出較好的安全性和免疫保護率[51]。豬用疫苗的氣溶膠免疫研究起步較晚，1999年奧地利報道用滅活的胸膜肺炎放線桿菌給豬做氣霧免疫，證明可以產(chǎn)生良好的細胞和體液免疫保護[26]。郭全勝等[27]進行了豬瘟氣霧免疫實驗研究，表明氣霧法免疫雖然與注射免疫差異不顯著，但是避免了類似注射免疫因漏打、打量不足造成豬抗體水平參差不齊現(xiàn)象的發(fā)生。豬流感疫苗采用氣溶膠免疫后，比氣管注射及其他黏膜途徑的免疫提供了更好的保護[28]。筆者也開展了豬支原體肺炎活疫苗的氣溶膠免疫研究，可將活疫苗顆粒輸送到豬下呼吸道并定植，同時使接種豬呼吸道產(chǎn)生良好的黏膜免疫應答[29]。對于人用疫苗的氣溶膠免疫，報道最多的集中在麻疹疫苗、結(jié)核疫苗和流感疫苗。其中麻疹疫苗是目前唯一在臨床開展大規(guī)模氣溶膠免疫研究的試用疫苗[25]。但到目前為止，還沒有被批準的人用氣溶膠疫苗上市。

盡管氣溶膠免疫在安全性、高效性和便利性方面具有顯著的優(yōu)勢，但肌肉注射或皮下注射疫苗仍是目前的標準接種方式。氣溶膠免疫技術的發(fā)展還需對氣溶膠疫苗的靶向性選擇及免疫后的評價與監(jiān)測開展研究。對于黏膜免疫首先需要確定適當?shù)陌薪M織，不同疫苗的靶組織可能有所不同。呼吸道疫苗接種可針對鼻腔、咽部和喉部的上呼吸道或氣管、支氣管、細支氣管和肺的下呼吸道，其中氣溶膠疫苗更多地沉積在下呼吸道，以供肺泡巨噬細胞和樹突狀細胞攝取。但對于如何確定最佳靶組織及其免疫激活機制尚未完全了解，對于如何評價和比較不同靶組織的科學方法也尚未成熟[52]。在評價氣溶膠疫苗接種途徑的同時，需要探索氣溶膠疫苗接種的免疫監(jiān)測新方法。支氣管鏡檢查和支氣管肺泡灌洗可能是黏膜免疫最有力和有代表性的樣本，但仍是一種侵入性方法。在人醫(yī)領域，誘導痰是一種可用于呼吸道黏膜免疫監(jiān)測的方法。誘導痰已被用于評估哮喘、囊性纖維化和健康志愿者的氣道炎癥，也可作為結(jié)核病患者的免疫分析[53,54]。在動物領域，鼻腔拭子已被用于豬肺炎支原體感染監(jiān)測或免疫后的評價的分析樣本[55]。此外，篩選血液中與呼吸道黏膜免疫相關的標志物，以及對黏膜歸巢受體的研究，將是一種有用的非侵入性免疫監(jiān)測工具。另外，氣溶膠免疫技術要注意個別疫苗和特殊接種個體的使用局限，例如流感疫苗可能由于其人畜共患的潛力而在環(huán)境上作氣溶膠免疫需考慮潛在的風險；針對存在支氣管痙攣或肺部炎癥的人群或動物，靶向下呼吸道的氣溶膠疫苗免疫也可能誘發(fā)或加重病情等。

作為一種潛在的替代傳統(tǒng)注射免疫的新方法，氣溶膠疫苗接種是一種安全、非侵入性、非創(chuàng)傷性的抗原傳遞方法，不僅可以避免因不適當?shù)淖⑸洳僮鞫鴤鞑ゼ膊『推渌葱圆≡w的風險，也降低了注射可能產(chǎn)生的刺激[56]。同時，氣溶膠免疫因遵循病原體感染的自然途徑，可模擬誘導呼吸道免疫應答，并可能導致更廣泛的全身免疫。在動物疫苗領域，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，氣溶膠免疫在節(jié)約人力成本方面將表現(xiàn)出更顯著的優(yōu)勢。2014年世界衛(wèi)生組織(WHO)已將氣溶膠免疫技術列入可指導和促進世界公共衛(wèi)生戰(zhàn)略的優(yōu)先開發(fā)技術領域之一[57]。