涂 騰，丁俊仁，3*，李思聰，魏 勇，李旭廷，楊 銳，梁 歌，范景勝

(1.四川省畜牧科學研究院，成都 610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066；3.四川省畜牧總站，成都 610066)

1 材料與方法

1.1 試驗藥物及檢測試劑 參金止痢口服液是由黨參15 g、金銀花 10 g、干姜 10 g、半夏 15 g、藿香 10 g、甘草 10 g、茯苓 10 g、陳皮 10 g 和白術(shù) 10 g 加水煎煮，制成每1 g含原生藥3.2 g的提取物后，再用純化水配成濃度為3.2 g生藥/mL的藥液(達到最大可抽吸濃度)，由四川省畜牧科學研究院自制。IL-1β、IL-6、TNF-α所用ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計 選用7～15日齡體重相近的“杜×長×大”三元雜交仔豬共計9頭，其中自然染毒并帶有腹瀉癥狀的哺乳仔豬6頭，所有仔豬均選自東河牧業(yè)有限公司豬場，以3頭為一組隨機將其分為兩組，分別是腹瀉空白組(FXK)和腹瀉中藥組(FZ)，另選3頭健康仔豬作為健康空白組(JK)，三個組同時進行處理，F(xiàn)Z組灌服參金止痢口服液，給藥量為4 mL/頭，灌胃給藥，每天兩次，連續(xù)灌胃5 d，F(xiàn)XK組及JK組則灌胃相應(yīng)劑量的生理鹽水(4 mL/頭)，每天兩次，連續(xù)灌胃5 d。

1.3 試驗動物飼養(yǎng)管理 實驗開始前對豬舍、料槽及水槽均進行全面消毒，對實驗仔豬采取分舍飼養(yǎng)措施，每組單獨一欄飼養(yǎng)，每一欄哺乳母豬均健康且體況相近，保持豬舍溫度正常恒定，并按常規(guī)程序進行免疫和驅(qū)蟲，自由采食和飲水。

1.4 實驗樣品采集 在對仔豬給藥后的第8天對各組進行采樣，用注射器從頸靜脈采取新鮮血液10 mL裝入15 mL 滅菌指形管，37 ℃恒溫箱內(nèi)靜止1 h，然后置于4 ℃冰箱后過夜，而后4 ℃，3000 r/min離心10 min，分離血清，分裝成小份后儲藏在-20 ℃，用于分析血液抗體及細胞因子水平。采血完畢后，將仔豬采用頸靜脈放血的方法處死然后立即打開腹腔，迅速結(jié)扎并分離出結(jié)腸，在結(jié)腸中段各取10 g左右食糜，裝入15 mL 滅菌指形管中并迅速放入-80 ℃冰箱中進行超低溫保存，用于后續(xù)的腸道菌群測序。

1.5 血清中抗體及細胞因子水平的測定 血清中IgG和IgM濃度應(yīng)用全自動生化分析儀根據(jù)使用說明書進行測定；血清中細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α應(yīng)用ELISA試劑盒根據(jù)相應(yīng)使用說明書進行測定。

1.6 結(jié)腸微生物總DNA抽提及PCR擴增測序 對超低溫保存以待測序的樣本嚴格按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書對各樣本的總DNA進行抽提，抽提完成后采用Nanodrop及1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測對抽提出的DNA進行質(zhì)檢。

質(zhì)檢合格的DNA樣本利用前端引物338F 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3', 806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶對細菌16S rRNA的V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，在擴增樣本中設(shè)置陰性對照，擴增完畢后對PCR擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若樣品條帶清晰且陰性對照未出現(xiàn)條帶則質(zhì)檢合格，可作為測序樣本。檢測合格后的測序樣本根據(jù)Illumina MiSeq測序平臺(Illumina 公司，美國)的標準操作流程進行建庫測序，原始數(shù)據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中。

根據(jù)目標大橋所采用的懸掛導向機構(gòu)的懸掛油缸參數(shù)可知,油缸的行程為50 mm,因此,懸掛系統(tǒng)的適應(yīng)高度差為50 mm,滿足懸掛導軌不平度±25 mm的要求.

1.7 測序結(jié)果分析 將測序所得的原始序列數(shù)據(jù)進行質(zhì)控和過濾，對過濾后的數(shù)據(jù)(OTU)進行聚類和物種分類學以及物種組成分析、Alpha/Beta多樣性分析，并采用LEfSe分析比較各分組腸道菌群在物種分類水平上的差異。

1.8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行處理，采用單因素方差進行分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(X±S)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 參金止痢口服液對哺乳仔豬血清免疫指標的影響 由表1可知，三個組在IgG的含量上，F(xiàn)XK組顯著低于FZ組和JK組(P<0.05)，在IgM的含量上，F(xiàn)XK組顯著高于FZ組和JK組(P<0.05)，在IL-1β的含量上，F(xiàn)XK極顯著高于FXZ和JK(P<0.01)，IL-6含量上，F(xiàn)XK組極顯著高于FZ組(P<0.01)，顯著高于JK組(P<0.05)，TNF-α含量上，F(xiàn)XK組極顯著高于FZ組和JK組(P<0.01)。

表1 參金止痢口服液對哺乳仔豬血清免疫指標的影響Tab 1 The effect of Shenjin Zhili Oral Liquid on Serum immune index of suckling piglets

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

2.2 參金止痢口服液對哺乳仔豬腸道微生物菌群的影響

2.2.1 測序樣品16S RNA高通量測序結(jié)果 測序結(jié)果表明，樣品平均有效序列條數(shù)為51171條，有效序列占測序序列總條數(shù)的90%以上(表2)。序列長度分布在350～440 bp內(nèi)，其中長度在430 bp的序列最多，序列長度分布情況與16S rDNA V3-V4序列長度相吻合，說明測序效果較理想，可用于后續(xù)分析。

表2 樣本測序序列情況統(tǒng)計表Tab 2 Sample sequencing sequence statistics table

2.2.2 OTUs分析及物種注釋 Venn圖顯示不同組之間共有及特有的OTUs個數(shù)，如圖1 A所示，三個組共鑒定出3898個OTU，其中三個組共有的OTU共72個，占1.85%；FZ組和FXK組共有的OTU共59個，占1.51%；FZ組和JK組共有的OTU共147個，占3.77%；JK組和FXK組共有的OTU共63個，占1.62%；說明各組間菌群類別差異較大，從各組總體及各自特有的OTU數(shù)量上看，F(xiàn)XK組較另外兩組顯著降低，而FZ組和JK組則較為接近，說明腹瀉可影響哺乳仔豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)，造成菌群多樣性降低，而參金止痢口服液可在一定程度上維持腹瀉仔豬的腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性趨于正常水平。

2.2.3 菌群 α 多樣性分析 α多樣性反映的是單個測序樣本自身內(nèi)部的微生物物種多樣性情況。其中Alpha指數(shù)稀釋曲線用來表示不同測序深度樣本的物種豐富程度，當曲線趨于平緩時表明此時的測序深度已基本覆蓋了測序樣本的所有物種，可反映該樣本的總OTU數(shù)。由圖1 B所示，三組樣本的曲線隨著本實驗測序深度的增加都分別先后出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)折點并隨后趨于平緩，說明本實驗深度充分，能反映各樣本的總OTU數(shù)。

Coverage指數(shù)是指各測序樣品的文庫覆蓋率，本實驗各組測序樣本中的文庫覆蓋率均在0.95以上，說明樣本中未被測出序列的概率較低。Observed species指數(shù)反映所測序樣品所含的物種數(shù)目，Chao1指數(shù)反映樣本所含OTU數(shù)目指數(shù)，Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)均反映樣本所含物種多樣性及分布均勻度，以上指數(shù)數(shù)值越大表明樣品物種多樣性越高，其中Shannon指數(shù)越大說明各物種分布越均勻， 本實驗中，F(xiàn)Z組、JK組的Observed species、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)(表3)均較FXK組均呈升高趨勢。

豐度等級曲線(Rank abundance)用以表示被測序物種的豐度和均勻度，曲線的水平寬度表示物種的豐富度，而曲線下降的平滑程度則反映物種的均勻度。由圖1 C可知所測樣本的曲線水平寬度較寬且下降趨勢較平緩，說明測序樣本中物種的豐富度和均勻度均較合理。

表3 各組仔豬腸道菌群多樣性指數(shù)Tab 3 Diversity index of intestinal flora of piglets in each group

圖1 腸道菌群OTUs分析及α多樣性分析(A.Venn圖；B.Alpha指數(shù)稀釋曲線；C.豐度等級曲線)Fig 1 OTUs analysis and α diversity analysis of intestinal flora(A.Venn diagram;B.Alpha Exponential Dilution Curve;C.Abundance Rating Curve)

2.2.4 菌群β多樣性分析 β多樣性反映的是不同測序樣本之間的微生物物種多樣性情況。本實驗同時采用主成分分析(PCA)、主坐標分析(PCoA)和非度量多維尺度分析(NMDS)進行分析。通過PCA和PCoA分析結(jié)果顯示，3組的菌群結(jié)構(gòu)差異明顯(圖2 A，B)。而NMDS分析可通過點與點的距離體現(xiàn)樣本之間的差異大小，結(jié)果表明3個組之間樣本的腸道菌群構(gòu)成有明顯差異(圖2 C)。

圖2 腸道菌群β多樣性分析(A.主成分分析(PCA)；B.主坐標分析(PCoA)；C.非量度多維尺度分析(NMDS))Fig 2 Analysis of β diversity of intestinal flora(A.Principal component analysis (PCA)；B.Principal coordinate analysis (PCoA);C.Analysis of non-metric multi-dimensional scaling(NMDS))

2.2.5 腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)分析 門水平上，3個組共檢測出12個菌門，由圖3可知，仔豬腸道中排名前十的優(yōu)勢菌門分別是厚壁菌門(Firmicutes，43.9%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，19.44%)、變形菌門(Proteobacteria，18.06%)、梭桿菌門(Fusobacteria，12.97%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，3.05%)、螺旋體門(Spirochaetes，1.96%)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes，0.24%)、放線菌門(Actinobacteria，0.20%)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae，0.008%)、藍菌門(Cyanobacteria，0.004%)，以上菌門占總菌門的99%以上。

圖3 門水平上的腸道微生物相對豐度Fig 3 Relative abundance of intestinal microbes at the phylum level

組間存在顯著差異的菌門有擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)(表4)，其中擬桿菌門FXK組顯著低于FZ組(P<0.05)，而變形菌門FXK組顯著高于FZ組(P<0.05)，極顯著高于JK組(P<0.01)。

表4 各組間差異顯著菌群的相對豐度(%)Tab 4 The relative abundance of the significant differences on intestinal flora between the groups

屬水平上，仔豬腸道中前20位的優(yōu)勢菌屬分別為乳桿菌屬(Lactobacillus，12.49%)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus，7.31%)、梭桿菌屬 (Fusobacterium，5.42%)、擬桿菌屬(Bacteroides，4.67%)、顫螺菌屬(Oscillospira，3.86%)、阿克曼氏菌屬(Akkermansia，3.05%)、普雷沃氏菌屬(Prevotella，2.49%)、考拉桿菌屬 (Phascolarctobacterium，2.13%)、密螺旋體屬(Treponema，1.95%)、瘤胃球菌([Ruminococcus]，1.84%)、多雷亞菌屬(Dorea，1.42%)、鏈球菌屬(Streptococcus，1.05%)、羅斯氏菌屬(Roseburia，0.96%)、副擬桿菌屬(Parabacteroides，0.90%)、丁酸弧菌屬(Butyricimonas，0.64%)、韋榮球菌屬(Veillonella，0.41%)、梭菌屬(Clostridium，0.40%)、SMB53屬(0.39%)、布勞特氏菌屬(Blautia，0.32%)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio，0.32%)，以上菌屬占總菌屬的比例為52.02%(圖4)。三組間存在顯著差異的菌屬共83種，其中屬于排名前20的優(yōu)勢菌屬共3種(表4)，除普雷沃氏菌屬屬于擬桿菌門外，乳桿菌屬及韋榮球菌屬均屬于厚壁菌門。

圖4 屬水平上的腸道微生物相對豐度Fig 4 Relative abundance of intestinal microbes at the genus level

2.2.6 腸道微生物菌群差異分析 為了進一步探究對組間菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響的菌群，對各組樣本進行了LEfSe分析，該分析可實現(xiàn)多個分組間差異的比較，從而篩選出在豐度上具有顯著差異的菌種。LDA score柱狀圖展示了LDA值大于設(shè)定值(本實驗?zāi)J為2)的物種，結(jié)果顯示(圖5)，F(xiàn)Z組在Prevotella(普氏菌屬)、Coprococcus(糞球菌屬)豐度較高，F(xiàn)XK組在Bacilli(芽孢桿菌綱)、Lactobacillus(乳桿菌屬)、Collinsella(柯林斯氏菌屬)、Shigella(志賀氏桿菌屬)豐度較高。

圖5 各組腸道菌群的LEfSe分析圖Fig 5 LEfSe chart of each group of intestinal flora

3 討論與結(jié)論

仔豬腹瀉是現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)較為常見的疾病，其發(fā)病率高、發(fā)病原因復雜、發(fā)病后死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)影響較大。參金口服液組方源自“半夏藿香湯”，具有芳香化濕、和胃止嘔之功效，用于脾胃不和與霍亂吐瀉之癥，前期臨床治療研究結(jié)果已表明其對治療仔豬腹瀉的藥物有效率較高，具有較好的防治效果[3-4]。

IgG、IgM是機體內(nèi)主要的免疫球蛋白，由活化的B淋巴細胞產(chǎn)生，可反映機體體液免疫狀況。其中，IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，約占整個血清免疫球蛋白含量的70%～75%，在抗細菌、抗毒素和抗病毒中起著的主要作用，IgM 是活化B細胞受抗原刺激后產(chǎn)生的最早的免疫球蛋白，在機體初期體液免疫中起著重要作用[5-6]。本研究中，腹瀉中藥組(FZ)的IgG含量顯著高于腹瀉組，說明參金止痢口服液顯著提高了腹瀉仔豬腸道中IgG的含量水平，而IgM在腹瀉組(FXK)的含量顯著高于腹瀉中藥組(FZ)和健康空白組(JK)，可能是因為腹瀉組的IgM并未進行病原清除，因而其濃度并未發(fā)生顯著變化，而治療組和空白組的IgM均進行了體內(nèi)病原的清除，因而濃度隨清除作用迅速下降，其具體機制還需進一步探究[7-8]。IL-1β、IL6、TNF-α均屬于促炎因子，在炎癥的發(fā)生及發(fā)展進程中起著重要作用，本研究中治療組IL-1β、IL6、TNF-α含量均較腹瀉組顯著降低并趨近于正常值，說明參金止痢口服液參與并調(diào)節(jié)了腹瀉仔豬的炎性因子水平。

α多樣性分析可反映單個測序樣本自身內(nèi)部的微生物物種多樣性情況，其中α指數(shù)稀釋曲線可表示不同測序深度情況下樣本的物種豐富程度，當曲線趨于平緩時說明測序深度已基本覆蓋樣本所有物種，本研究中三組樣本均先后出現(xiàn)了較平緩的曲線，說明三組樣本測序深度均充分，能反映各樣本總OTU數(shù)。Coverage指數(shù)指各測序樣品的文庫覆蓋率，本研究中各組均為0.95以上，說明未被測出序列較少，序列可靠程度高。而Observed species指數(shù)反映測序樣品所含物種數(shù)目，Chao1指數(shù)反映樣本所含OTU數(shù)目指數(shù)，Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)均反映樣本所含物種多樣性及分布均勻度，以上指數(shù)數(shù)值越大表明樣品物種多樣性越高，通過對比發(fā)現(xiàn)，本研究中腹瀉空白組(FXK)腸道菌群多樣性較健康空白組(JK)低，這與Hermann-Bank等的報道一致[9]。而腹瀉中藥組(FZ)的多樣性較健康空白組(JK)和腹瀉空白組(FXK)高，可能是因為參金止痢口服液在一定程度上提高了腹瀉仔豬的腸道菌群多樣性。β多樣性分析可反映不同測序樣本之間的微生物物種多樣性情況，本研究采用主成分分析(PCA)、主坐標分析(PCoA)和非度量多維尺度分析(NMDS)進行分析，結(jié)果表明，三個組之間腸道菌群結(jié)構(gòu)具有較為明顯的差異，且FXK組較FZ組和JK組差異更顯著，說明參金止痢口服液可能參與調(diào)節(jié)腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮治療腹瀉的作用。

腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，在門水平上，三個組厚壁菌門、擬桿菌門，變形菌門占了總菌群相對豐度的80%以上，為主要優(yōu)勢菌群，這與Chen 等[10]的研究一致，Bin P等[11]研究發(fā)現(xiàn)，相比正常仔豬，腹瀉仔豬腸道中擬桿菌門的相對豐度較低，而Liu C S等[12]發(fā)現(xiàn)，腹瀉仔豬腸道中變形菌門相對豐度增加而擬桿菌門相對豐度降低。本研究發(fā)現(xiàn)FZ組仔豬腸道擬桿菌門相對豐度顯著高于FXK組，變形菌門相對豐度顯著低于FXK組，而FZ組與JK組之間擬桿菌門及變形菌門的相對豐度差異均不顯著。這些結(jié)果說明，參金止痢口服液可以調(diào)節(jié)腹瀉仔豬腸道中某些菌門的相對豐度，使相對豐度趨近于正常。

屬水平上存在顯著差異的菌屬有三種，分別是乳桿菌屬(Lactobacillus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)以及韋榮球菌屬(Veillonella)，乳酸菌是一種常用的益生菌，在腸道中起著與腸道中病原菌競爭腸粘膜結(jié)合位點，抑制腸道中病原體、維持腸道正常菌群的作用[13]，有研究表明，乳桿菌屬能降低仔豬的腹瀉率[14]，本研究中乳桿菌屬在FXK組的相對豐度顯著大于FZ組，與JK組差異不顯著，而汪群[15]等研究也發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬腸道中乳桿菌屬的相對豐度顯著高于健康仔豬，與本研究結(jié)論一致。先前的研究發(fā)現(xiàn)，韋榮球菌屬的豐度在感染流行性腹瀉仔豬的腸道中上調(diào)顯著，屬于感染流行性病毒腹瀉仔豬腸道中的優(yōu)勢菌群[16-17]。De等[18]發(fā)現(xiàn)在非洲兒童中利用普氏菌屬抑制致病性志賀氏菌屬可降低胃腸道疾病及腹瀉的發(fā)病率。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XK組仔豬韋榮球菌屬的豐度顯著高于FZ組，而FZ組和JK組無顯著差異，F(xiàn)Z組普氏菌屬豐度顯著高于FXK組，而FZ組和JK組無顯著差異，說明參金止痢口服液可能通過調(diào)節(jié)腸道中某些菌群的結(jié)構(gòu)從而抑制了腹瀉仔豬腸道中某些有害菌的增殖。

本研究采用LEfSe(LDA effect size)分析在各組之間具有顯著差異的貢獻菌及類型，結(jié)果表明，F(xiàn)XK組發(fā)現(xiàn)4個分類群，分別為志賀氏菌屬、柯林斯菌屬、芽孢桿菌綱和乳桿菌屬，有報道表明致病性的志賀氏桿菌可造成仔豬腹瀉，推測志賀氏桿菌可能是造成仔豬腹瀉的潛在病原菌[19-20]。乳桿菌屬屬于芽孢桿菌綱，其可調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，并通過乳酸發(fā)酵刺激宿主免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細菌素，調(diào)節(jié)腸道pH從而影響宿主健康[21]，本研究腹瀉組腸道中乳桿菌屬豐度較治療組和空白組更高，該結(jié)論與汪群等的結(jié)論一致[15]，柯林斯氏菌屬被發(fā)現(xiàn)在腹瀉的貓腸道中豐度增加顯著，該菌被證實在哺乳動物炎癥性腸病的治療中有良好的效果[22-23]，以上菌屬豐度的升高可能是由于這兩種菌在腹瀉仔豬腸道中起到了保護和調(diào)節(jié)作用，具體機制還有待進一步研究。FZ組發(fā)現(xiàn)兩個分類群，分別為Coprococcus(糞球菌屬)和Prevotella(普氏菌屬)，Kang等[24]發(fā)現(xiàn)在健康兒童腸道中普氏菌屬與志賀氏菌屬的豐度呈負相關(guān)，本研究FZ組腸道中普氏菌屬相對豐度顯著高于FXK組，志賀氏菌屬含量則低于FXK組，且FZ組這兩種菌的相對豐度與JK組仔豬差異不顯著。糞球菌屬的代謝產(chǎn)物在結(jié)腸上皮細胞中起著提供細胞能量供應(yīng)的作用，同時也參與了腸道免疫調(diào)節(jié)和腸屏障功能的建立和維持[25]，以上菌屬豐度的變化可能是由于參金止痢口服液參與調(diào)節(jié)了腹瀉仔豬腸道中某些有益菌屬的相對豐度并降低致病菌屬的豐度，從而使腸道菌群其趨于正常。

綜上所述，參金止痢口服液可能參與調(diào)節(jié)了免疫相關(guān)及炎性相關(guān)因子的表達量，同時增加了腹瀉仔豬腸道中有益菌擬桿菌門、普氏菌屬等的相對豐度，降低了有害菌變形菌門、韋榮球菌屬、志賀氏菌屬等的相對豐度并調(diào)節(jié)腹瀉仔豬腸道菌群使之趨于正常，從而緩解了仔豬腹瀉癥狀，起到了治療仔豬腹瀉的作用。