陸 游，南文龍，鞏明霞，李 林，鄒艷麗，吳曉東，彭大新，陳義平*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(Lumpy skin disease，LSD)是一種由羊痘病毒屬牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)引發(fā)的急性、亞急性傳染病[1]。該病臨床表現(xiàn)為皮膚水腫及局部堅(jiān)硬的結(jié)節(jié)、結(jié)痂或潰瘍，懷孕牛流產(chǎn)，奶牛產(chǎn)奶量減少，公牛暫時(shí)或永久不育，商品牛的肉質(zhì)或皮張利用率明顯下降[2-3]。2019年8月，LSD疫情首次發(fā)生于我國新疆伊犁州，2020年6月以來，我國福建長汀、江西贛州、廣東潮州、安徽黃山、浙江金華等地又確診發(fā)生該疫情[4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部暫時(shí)將其作為二類動(dòng)物疫病管理。

根據(jù)《牛結(jié)節(jié)性皮膚病防治技術(shù)規(guī)范》，我國采用山羊痘弱毒疫苗AV41株，按山羊的五倍劑量免疫牛來預(yù)防LSD[5]。但弱毒疫苗的使用可對LSDV野毒的診斷和監(jiān)測產(chǎn)生干擾[6-7]。當(dāng)前尚無AV41株的特異性鑒別檢測方法，本研究擬篩選、驗(yàn)證AV41株基因組獨(dú)特性分子標(biāo)記，為該疫苗株與我國LSDV野毒株的鑒別提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株 山羊痘弱毒疫苗AV41株購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司、山東綠都生物科技有限公司，山羊痘病毒+小反芻獸疫病毒二聯(lián)弱毒疫苗(AV41株+Clone 9株)購自華派生物工程集團(tuán)有限公司。中國LSDV野毒株LSDV/China/XJ2019-1由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離鑒定。

1.2 試劑與儀器 磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，PCR擴(kuò)增試劑2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)購自Vazyme公司，毛細(xì)管電泳儀及DNA Marker購自QIAGEN公司，引物由睿博興科(青島)有限公司合成。

1.3 病毒核酸提取 采用磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，提取中國LSDV野毒株和不同廠家來源的山羊痘弱毒疫苗AV41株的基因組DNA，廠家代號為A、B、C。

1.4 基因組分子標(biāo)記篩選 從GenBank中下載已有的全部27 株LSDV基因組全序列(GenBank登錄號：MN995838.1、MT130502.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT134042.1、MT643825.1、AF325528.1、AF409137.1、MH646674.1、MT992618.1、MN636843.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、MG972412.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、AF409138.1、MT134042.1)，除AV41株以外全部11 株GTPV基因組全序列(GenBank登錄號：MN072621.1、KC951854.1、MN072625.1、MN072624.1、MN072623.1、MN072623.1、MN072620.1、KX576657.1、MW020570.1、AY077836.1、AY077835.1)和全部的12 株綿羊痘病毒(Sheep poxvirus，SPPV)基因組全序列(GenBank登錄號：MN072631.1、MN072630.1、MN072629.1、MN072628.1、MN072627.1、MN072626.1、MW020571.1、AY077834.1、AY077833.1、AY077832.1、KT438551.1、KT438550.1)。利用生物信息學(xué)軟件BLAST和DNAstar，將AV41株基因組全序列(GenBank登錄號：MH381810.1)逐段與上述LSDV、GTPV、SPPV基因組全序列進(jìn)行比較，分析篩選AV41株基因組分子標(biāo)記。

1.5 測序驗(yàn)證 于1.4篩選的AV41株分子標(biāo)記所在的基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物，采用1.3方法制備的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物測序，驗(yàn)證不同來源的AV41株相關(guān)分子標(biāo)記位置的基因組序列，并與我國LSDV 野毒株基因相比較，確認(rèn)AV41株基因組獨(dú)特分子標(biāo)記存在及分布情況。

反應(yīng)體系25 μL：2×Vazyme Taq Plus Master Mix(Dye Plus)12.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，核酸模板2 μL，無核酸酶水8.5 μL。

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸6 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束，利用毛細(xì)管電泳儀分析結(jié)果，PCR 產(chǎn)物送睿博興科(青島)有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組分子標(biāo)記篩選 將AV41株基因組全序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫下載中的27株LSDV、11株GTPV、12株SPPV基因組全序列進(jìn)行比較，共篩選獲得19個(gè)AV41 株分子標(biāo)記，包含4個(gè)插入標(biāo)記，4個(gè)缺失標(biāo)記和11個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記(表1)，而其余LSDV、GTPV、SPPV毒株基因組全序列對比結(jié)果中，尚未發(fā)現(xiàn)上述19個(gè)標(biāo)記。根據(jù)分子標(biāo)記所在基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物(表2)，其中，EEV maturation protein基因采用兩組引物擴(kuò)增，一組用于G2261T位點(diǎn)測序，另一組用于2285C2286與ΔC2293-2294兩個(gè)位點(diǎn)測序。IL-1R基因的C582A和T571G位點(diǎn)采用同一組引物進(jìn)行擴(kuò)增測序。

表2 AV41 分子標(biāo)記測序驗(yàn)證用PCR 引物Tab 2 PCR primers for molecular marker sequencing verification of AV41

2.2 測序驗(yàn)證 以中國LSDV野毒株和不同廠家生產(chǎn)的AV41株的基因組DNA為模板，對2.1中19個(gè)分子標(biāo)記所在位置相應(yīng)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳顯示，擴(kuò)增基因目的條帶均與預(yù)期大小相符(圖1)。經(jīng)測序驗(yàn)證，并與LSDV野毒株基因組相關(guān)位置序列相比，其中7個(gè)為AV41基因組獨(dú)有的分子標(biāo)記，包括2個(gè)插入標(biāo)記(DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832)和5個(gè)SNP位點(diǎn)標(biāo)記(GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit 基因T64C和Myristylated protein基因C746A)，具體見表1與圖2。

1：15-3000bp Marker；2：GTPV_gp001 gene；3：IL-1R gene；4：EEV maturation protein gene (G2261T)；5：GTPV_gp058 gene;6：GTPV_gp066gene；7：Virion core protein gene；8：DNA ligase gene；9：GTPV_gp021 gene；10：GTPV_gp020 gene；11：DNA-binding viron core protein gene；12：EEV maturation protein gene (2285C2286+ΔC2293～2294)；13：RNA polymerase subunit gene；14：Myristylated protein gene；15：TK gene；16：RING finger host range protein gene；17：Kelch-like protein gene；18：Ankyrin-like 圖1 AV41分子標(biāo)記所在基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 1 PCR amplification of marker genes of AV41

NCBI AV41、NCBI 27 LSDVs、NCBI 11 GTPVs、NCBI 12 SPPVs：NCBI數(shù)據(jù)庫中的1株AV41、27株LSDV、除AV41外的11株GTPV、12株SPPV序列；A-AV41、B-AV41、C-AV41：不同廠家生產(chǎn)的AV41；WT-LSDV：中國LSDV野毒株；方框所示堿基為差異堿基；“-”：表示該處堿基缺失NCBI AV41, NCBI 27 LSDVs, NCBI 11 GTPVs, NCBI 12 SPPVs：1 strain of AV41, 27 strains of LSDV, 11 strains of GTPV except for AV41 and 12 strains of SPPV in NCBI database; A- AV41, B- AV41 and C-AV41：AV41 strains produced by different manufacturers；WT-LSDV：wild-type LSDV in China. The bases shown in the box are different bases；"-"：base deletion圖2 AV41 7個(gè)獨(dú)特分子標(biāo)記所在基因序列對比Fig 2 Sequence comparison of seven specific molecular markers for AV41

3 討論與結(jié)論

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒與山羊痘病毒、綿羊痘病毒同為羊痘病毒屬成員，相互間基因組全序列同源性高達(dá)95%[8]，編碼主要抗原的基因序列相近。因此，采用同屬同源或異源弱毒疫苗株進(jìn)行免疫，都可預(yù)防牛結(jié)節(jié)性皮膚病。國際上用于LSD免疫的同源疫苗株有Neethling株與0240/KS-1株，異源疫苗株有SPPV RM65株與Romanian株，GTPV_Mysore株與Gorgan株等。非洲、中東、巴爾干等LSD流行地區(qū)的防控經(jīng)驗(yàn)顯示，采用弱毒疫苗免疫有效控制了該病的傳播擴(kuò)散[9-10]。

分子生物學(xué)方法是鑒別野毒株與疫苗株的主要手段，如熒光探針法和高分辨率熔解峰分析法(High-resolution melting,HRM)等。Eirini等根據(jù)Neethling株在G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體基因處插入的12 bp堿基，設(shè)計(jì)了雙重探針的熒光定量PCR方法，可以區(qū)分Neethling_vaccine_LW疫苗株和LSDV_Turkey_2014等9種LSDV野毒株[11]。Tesfaye等基于SPPV疫苗株在B22R同源基因存在的21 bp與27 bp堿基缺失，建立了HRM分析法，可用于SPPV Romanian疫苗株等4種SPPV疫苗株與LSDV_Evros/GR/15等4種LSDV野毒株的鑒別[12- 13]。當(dāng)前，我國尚未開發(fā)或從國外引進(jìn)LSDV同源疫苗株。山羊痘弱毒疫苗AV41株可用于免疫山羊和綿羊預(yù)防GTPV與SPPV，已有近35年使用經(jīng)歷，證實(shí)其安全有效[14-15]。該疫苗株也可作為我國預(yù)防LSD的異源弱毒疫苗使用。鑒別診斷方面，聶福平等基于LSDV野毒株ORF126區(qū)域插入的26 bp堿基，建立了檢測LSDV野毒株的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法，僅特異性擴(kuò)增LSDV野毒株相關(guān)基因，而對異源疫苗AV41株無擴(kuò)增信號[16]。

目前，國內(nèi)尚無直接鑒別檢測AV41株的方法。本研究將AV41株基因組全序列與GenBank中的LSDV、GTPV和SPPV毒株序列比較，對中國LSDV野毒株和不同廠家生產(chǎn)的AV41株相關(guān)基因測序，證實(shí)其中7 個(gè)分子標(biāo)記為AV41株獨(dú)特性，包括DNA ligase基因2433A2434、Kelch-like protein基因1831A1832、GTPV_gp020基因G203A、GTPV_gp021基因C681T、DNA-binding viron core protein基因C47T、RNA polymerase subunit基因T64C、Myristylated protein基因C746A。上述結(jié)果顯示，所選分子標(biāo)記可用于我國山羊痘弱毒AV41株和LSDV野毒株的病原鑒別，即對分子標(biāo)記位置采用直接測序的方法，可鑒定為疫苗株或野毒株；或基于分子標(biāo)記中的SNP位點(diǎn)，開發(fā)可用于區(qū)分相關(guān)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR方法；或基于插入位點(diǎn)，建立可區(qū)分野毒株與疫苗株不同熔解曲線峰圖的高分辨率熔解峰分析法等。本研究可為我國LSD防控工作提供技術(shù)支持，也可進(jìn)一步為山羊痘弱毒AV41株與國內(nèi)山羊痘病毒、綿羊痘病毒野毒株的鑒別提供參考。