孔文文 張昕

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心功能科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

慢性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、癌癥等老年慢性病患者晚期均可能伴發(fā)惡病質(zhì)，其特征是體重減輕及骨骼肌功能障礙。無(wú)論這些老年患者基礎(chǔ)的心肺功能如何，其骨骼肌功能障礙和肌肉受損的程度，可以預(yù)測(cè)患者的死亡率〔1〕。維持足夠的肌肉數(shù)量和保持肌肉良好的性能，有助于維持老年患者的日?；顒?dòng)并且提高其生存率。盡管造成老年慢性病患者惡病質(zhì)發(fā)生的原因還未明確，但氧化應(yīng)激、炎癥、低氧、低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、心血管系統(tǒng)功能失調(diào)等因素已被證實(shí)與其有關(guān)。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化劑增多，導(dǎo)致氧化劑和抗氧化劑不平衡，研究發(fā)現(xiàn)其是導(dǎo)致老年COPD患者呼吸肌和肢體肌肉功能障礙的主要原因，也是癌癥、敗血癥、老年患者肌肉功能障礙發(fā)生的主要原因〔2〕。體內(nèi)氧化劑的增高會(huì)改變蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等分子的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡。蛋白質(zhì)氧化特別是蛋白質(zhì)羰基化，會(huì)使酶活性、轉(zhuǎn)錄因子等發(fā)生變化，使蛋白質(zhì)更易發(fā)生降解〔3〕。蛋白質(zhì)羰基化貫穿于老年慢性病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的始終，在COPD，失用性肌肉萎縮，癌癥惡病質(zhì)，敗血癥，生理老化等的動(dòng)物模型中，已得到證實(shí)。本文將對(duì)蛋白質(zhì)羰基化在生理、病理狀態(tài)下的發(fā)生機(jī)制及檢測(cè)方法做以綜述。

1 蛋白質(zhì)羰基化的定義及檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)氧化的重要方式之一。其發(fā)生機(jī)制主要有：①Fenton和Haber-Weiss類(lèi)型的金屬離子催化反應(yīng)。金屬離子催化氧化劑與存在于蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的賴(lài)氨酸、精氨酸、脯氨酸和蘇氨酸之間形成羰基衍生物(醛類(lèi)和酮)，這是機(jī)體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)氧化的機(jī)制。②另一機(jī)制是Michael加成反應(yīng)〔4〕。此反應(yīng)是在細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)期間，由賴(lài)氨酸、半胱氨酸或組氨酸的殘基與α、β不飽和醛反應(yīng)生成的。③蛋白質(zhì)與活性氧(ROS)直接反應(yīng)也可能會(huì)形成含有高反應(yīng)性羰基的蛋白質(zhì)衍生物，或者形成含有高反應(yīng)性羰基的肽片段。④另外，賴(lài)氨酸殘基與還原糖或其氧化產(chǎn)物(由糖基化反應(yīng)或糖氧化反應(yīng)生成)的二次反應(yīng)也可能在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生活性羰基〔5〕。體內(nèi)長(zhǎng)期高水平的蛋白質(zhì)羰基化會(huì)過(guò)度激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，加速蛋白質(zhì)的分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

目前蛋白質(zhì)羰基化的檢測(cè)方法：通用的方法是酰肼檢測(cè)法，酰肼通過(guò)席夫醛的形式與蛋白質(zhì)羰基發(fā)生特異性反應(yīng)，并用氰基硼氫化鈉穩(wěn)定〔6〕。生物素酰肼常用來(lái)標(biāo)記和鑒定羰基化蛋白質(zhì)，再通過(guò)無(wú)凝膠方法及親和素親和層析法，最后質(zhì)譜分析進(jìn)行直接檢測(cè)。另外可用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記法鑒定蛋白質(zhì)中的羰基，能克服非羰基化蛋白質(zhì)中抗生物素蛋白(抗生物素蛋白的靜電性和疏水性的相互作用)影響實(shí)驗(yàn)背景的問(wèn)題。羰基化驗(yàn)也是量化蛋白質(zhì)氧化的一個(gè)準(zhǔn)確、可靠的方法，羰基化驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)到反應(yīng)性羰基與2，4-二硝基苯肼發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后生成2，4-二硝基苯酚，使用了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定，包括免疫印跡和免疫組織化學(xué)方法〔7〕。雖然羰基化驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生除了蛋白質(zhì)羰基化以外的其他形式的氧化修飾，但其結(jié)果可靠、操作簡(jiǎn)單方便使其在蛋白質(zhì)氧化的檢測(cè)中具有較大的實(shí)用價(jià)值。

2 生理狀態(tài)下的骨骼肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的羰基化

骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的氧化劑主要是超氧陰離子(O2-)和一氧化氮(NO)。正常情況下骨骼肌纖維收縮或者舒張時(shí)，則產(chǎn)生O2-或NO。在一氧化氮合酶作用下，NO與O2-反應(yīng)生成活性氧(ROS)，觸發(fā)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，是肌肉細(xì)胞產(chǎn)生力量的重要環(huán)節(jié)〔8〕。而骨骼肌細(xì)胞中的抗氧化劑主要包括存在于肌漿中的銅鋅超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和存在于線粒體基質(zhì)內(nèi)的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。另外，非酶抗氧化系統(tǒng)對(duì)抗氧化酶有補(bǔ)充作用，如存在于細(xì)胞膜上的脂溶性化合物維生素E，胡蘿卜素和泛醇等。ROS在信號(hào)通路的調(diào)控中可能起到關(guān)鍵作用，它能夠使肌肉更快地適應(yīng)于收縮和舒張。ROS的產(chǎn)生量及產(chǎn)生時(shí)間決定了其對(duì)組織的影響程度。氧化劑在短時(shí)間內(nèi)適度增加能夠激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞盡快適應(yīng)環(huán)境改變，同時(shí)免受壓力對(duì)肌纖維的進(jìn)一步的影響〔9〕。然而當(dāng)ROS過(guò)度增多或抗氧化劑合成減少會(huì)過(guò)度激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，加速蛋白質(zhì)的分解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡〔10〕。

2.1衰老導(dǎo)致的蛋白質(zhì)的羰基化 骨骼肌衰老被定義為隨著年齡的增長(zhǎng)，肌肉性能的降低和健康指數(shù)的下降。衰老的有害影響在老年患者的骨骼肌和神經(jīng)元等不可再生組織更容易被觀察到，因?yàn)槠鋼p傷或丟失的細(xì)胞不能被完整的有絲分裂細(xì)胞所替代。蛋白質(zhì)羰基化是細(xì)胞衰老的原因之一。一項(xiàng)針對(duì)老年人的研究結(jié)果顯示：老年人股四頭肌中谷胱甘肽的氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化、Mn-SOD和過(guò)氧化氫酶活性、蛋白質(zhì)羰基化、DNA氧化等化學(xué)反應(yīng)都有不同程度的增加；其腹直肌中的Mn-SOD活性也顯示出更高的活性〔11〕。老年女性表現(xiàn)出更高水平的總蛋白羰基化和硝化及肋間肌中Mn-SOD含量增高，而老年男性只在四肢肌肉中表現(xiàn)出蛋白加成化合物的增加〔12〕。另外在一個(gè)衰老的動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌數(shù)量減少與生長(zhǎng)激素、雌激素和雄激素生成減少，葡萄糖、脂肪酸、蛋白質(zhì)代謝異常，氧化應(yīng)激增加及體力活動(dòng)減少等有關(guān)〔13〕。在一項(xiàng)嚙齒類(lèi)動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，衰老的膈肌細(xì)胞內(nèi)氧化劑及抗氧化酶含量均會(huì)增高〔14〕。

2.2吸煙和蛋白質(zhì)羰基化 研究發(fā)現(xiàn)吸煙人群骨骼肌的蛋白質(zhì)羰基化水平顯著增加。老年長(zhǎng)期吸煙者的股四頭肌中，糖酵解酶、肌酸激酶、碳酸酐酶-3、ATP-合酶和結(jié)構(gòu)蛋白更容易被羰基化。老年吸煙者與老年非吸煙者相比較，老年長(zhǎng)期吸煙者股四頭肌的功能顯著降低，這說(shuō)明老年吸煙者肌肉中蛋白質(zhì)羰基化可能在某種程度上與股四頭肌功能降低有關(guān)〔15〕。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸香煙煙霧的豚鼠肌肉中的糖酵解酶、肌酸激酶、碳酸依賴(lài)酶-3、ATP合成酶和結(jié)構(gòu)蛋白更易羰基化。長(zhǎng)期香煙煙霧暴露可能對(duì)暴露動(dòng)物的所有肌肉產(chǎn)生直接的有害作用。無(wú)論動(dòng)物呼吸系統(tǒng)中是否發(fā)現(xiàn)了組織結(jié)構(gòu)的改變，香煙本身可能涉及的直接組織毒性(醛，過(guò)氧化物，氮氧化物和過(guò)氧化自由基等)都得到了強(qiáng)化。

3 病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)羰基化與骨骼肌功能障礙

3.1蛋白質(zhì)羰基化與失用性肌萎縮 長(zhǎng)期肌肉廢用可致肌肉數(shù)量顯著損失及肌肉功能的減退，例如在老年患者長(zhǎng)期臥床休息的情況下，由于長(zhǎng)期固定不動(dòng)，身體不活動(dòng)，導(dǎo)致肌肉量的減少和肌肉功能降低。固定肢體的老年動(dòng)物模型表明肌肉量的減少和肌肉性能的降低是肌肉中蛋白質(zhì)合成減少和蛋白水解速率增加的結(jié)果〔16〕。ROS水平增加可能與失用性肌肉萎縮的病理生理學(xué)相關(guān)。目前肌纖維中ROS的來(lái)源仍不明確，有幾個(gè)研究發(fā)現(xiàn)在骨骼肌萎縮過(guò)程中，黃嘌呤氧化酶和線粒體是誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的主要因素〔17〕。另外蛋白質(zhì)羰基化通過(guò)激活骨骼肌中的鈣蛋白酶，半胱天冬酶-3和泛素-蛋白酶體等蛋白水解系統(tǒng)可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)分解代謝來(lái)加速失用性肌肉萎縮〔10〕。

3.2蛋白質(zhì)羰基化與老年COPD患者 老年COPD患者骨骼肌功能障礙的特點(diǎn)是肌力和耐力的降低。氧化應(yīng)激是老年COPD患者(特別是重癥患者)的肌肉功能障礙的主要原因。有研究表明，老年COPD患者的血液、呼吸肌和四肢肌肉表現(xiàn)出高水平的脂質(zhì)過(guò)氧化、谷胱甘肽的氧化、蛋白質(zhì)的羰基化和硝化〔18〕。過(guò)多的ROS誘導(dǎo)減少蛋白質(zhì)翻譯后的修飾和增加骨骼肌纖維內(nèi)的關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的水解。老年COPD患者的局部和全身炎癥介質(zhì)水平都是相對(duì)較低的，而在其骨骼肌和血液中，存在較高的氧化應(yīng)激水平，其肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白重鏈等結(jié)構(gòu)蛋白和肌酸激酶、碳酸酐酶-3等酶氧化水平增高〔19〕。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的老年COPD患者膈肌中蛋白氧化水平更高，并與呼吸肌的功能及氣道阻塞程度呈負(fù)相關(guān)〔20〕。有研究已經(jīng)證實(shí)翻譯后的氧化修飾通常發(fā)生在對(duì)氧化敏感的蛋白質(zhì)氨基酸殘基中，這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失，或通過(guò)蛋白酶體加速蛋白質(zhì)降解。

3.3蛋白質(zhì)羰基化與癌癥惡病質(zhì) 癌性惡病質(zhì)被定義為體重減輕、肌肉萎縮、身體虛弱，并在沒(méi)有自愿減肥的情況下出現(xiàn)厭食癥，通常意味著預(yù)后不佳。老年惡病質(zhì)患者全身肌肉均會(huì)受到氧化劑類(lèi)似物的影響。在幾種癌癥惡病質(zhì)的動(dòng)物模型中，其氧化應(yīng)激水平升高。在患有肝癌腹水的惡病質(zhì)大鼠腓腸肌中，氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平，如總反應(yīng)性羰基、蛋白加成化合物、蛋白酪氨酸硝化等顯著增高〔21〕。蛋白質(zhì)羰基化誘導(dǎo)肌肉蛋白質(zhì)降解，通過(guò)交叉反應(yīng)機(jī)制，減少纖維長(zhǎng)度，特別是快收縮肌纖維(Ⅱ型纖維)的長(zhǎng)度，最終引發(fā)與癌癥和其他慢性病相關(guān)的惡病質(zhì)的全身效應(yīng)。機(jī)制可能與Ⅱ型纖維合成的過(guò)多的ROS，能誘導(dǎo)周?chē)鞍踪|(zhì)的氧化修飾，使其更易通過(guò)蛋白水解系統(tǒng)降解〔22〕。癌癥惡病質(zhì)的發(fā)生打破了氧化還原的平衡，誘導(dǎo)參與肌肉結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵蛋白氧化：例如參與糖酵解、ATP產(chǎn)生和分布、二氧化碳水化、肌肉收縮和線粒體代謝的蛋白質(zhì)均被羰基化。

3.4蛋白質(zhì)羰基化與膿毒血癥 膿毒血癥是指重癥感染的系統(tǒng)反應(yīng)，臨床表現(xiàn)包括如發(fā)熱、心動(dòng)過(guò)速、呼吸急促、白細(xì)胞增多和局部感染等。動(dòng)物研究表明，患有膿毒血癥的大鼠膈肌中蛋白的羰基化和硝化水平是增加的，這表明內(nèi)毒素血癥與呼吸肌力的減少息息相關(guān)〔23〕。在內(nèi)毒素血癥大鼠的膈肌中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)醛縮酶A，甘油醛-3-磷酸脫氫酶和烯醇酶3β，肌酸激酶，碳酸酐酶-3，可收縮的α-肌動(dòng)蛋白和線粒體泛醇-細(xì)胞色素C還原酶等糖酵解酶羰基化水平升高〔24〕。代謝和血流動(dòng)力學(xué)因素、細(xì)菌內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、花生四烯酸代謝、一氧化氮和氧化應(yīng)激等機(jī)制參與到膿毒血癥引起的呼吸肌功能障礙的發(fā)生。細(xì)胞分子如蘭尼堿受體，肌酸激酶和結(jié)構(gòu)蛋白(肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白)的氧化被列為由膿毒血癥誘發(fā)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图∪馐湛s功能障礙最相關(guān)的指標(biāo)之一。人類(lèi)研究表明，在嚴(yán)重膿毒血癥患者的呼吸和肢體肌肉中同樣檢測(cè)到了蛋白質(zhì)氧化和硝化水平的升高〔25〕。膿毒血癥患者的股外側(cè)肌蛋白質(zhì)羰基化水平明顯高于對(duì)照組，而在呼吸肌肉(肋間外肌)內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化水平?jīng)]有差異?？傊?，這些結(jié)果表明關(guān)鍵氨基酸的羰基化，特別是那些位于酶活性位點(diǎn)的氨基酸羰基化后，會(huì)干擾酶的活性。

綜上蛋白質(zhì)羰基化能通過(guò)誘導(dǎo)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的修飾，改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝，進(jìn)一步改變肌肉的功能。更重要的是，羰基化的蛋白質(zhì)可能更容易被骨骼肌纖維中的蛋白水解系統(tǒng)迅速降解，這是組織中蛋白質(zhì)氧化的重要形式，會(huì)增加老年慢性病晚期患者惡病質(zhì)的發(fā)生率。目前對(duì)這一領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到很大重視〔26〕。今后我們研究的方向可能涉及肌肉蛋白質(zhì)羰基化程度與肌肉功能和數(shù)量的降低程度的相關(guān)性及對(duì)羰基化敏感的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的探討。為防止老年惡病質(zhì)的發(fā)生和治療提供新的方法，為老年慢性病的治療提供新的思路。