王若琪,李建華,王志鵬,劉歡,張國良,高潔

(1.中國輻射防護研究院GLP中心，太原，030006；2.山西白求恩醫(yī)院腫瘤中心，太原，030032)

本實驗利用醫(yī)用直線加速器單次照射SD大鼠，模擬臨床腫瘤患者放療損傷。通過藥代動力學(xué)手段研究放療對卡培他濱體內(nèi)過程的影響，為臨床探索對正常組織毒性較小而治療窗增寬的治療方案提供參考依據(jù)，闡明放化療聯(lián)合治療中放療與化療間的相互作用，為腫瘤治療研究提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠12只，雄性，體重為(250±20)g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK-(京)2016-0011。

1.2 主要儀器

UPLC1690超高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；QTRAP3200質(zhì)譜儀，AB Sciex公司；QUINTIX35-1CN電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；GL21MC高速離心機，長沙英泰儀器有限公司；MixMax渦旋混合器，美國ABSON公司；HealForce Smart-mini超純水機，香港力康生物醫(yī)療科技控股集團；synergy醫(yī)用電子直線加速器，英國Elekta公司，檢定單位為河北嘉盛劑量有限公司，有效期至2022年5月。

1.3 主要試劑

卡培他濱片、希羅達，上海羅氏制藥有限公司；卡培他濱、5-氟尿嘧啶對照品，中國食品藥品檢定研究院；甲醇，質(zhì)譜級，美國Fisher公司。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(3.0×50 mm 1.7 μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫：0～15 min，95%→ 10%A；15～18 min，10%A；18～19 min，10%→ 95%A；19～21 min，95%A；柱溫30 ℃；流速0.2 mL/min；進樣體積3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜配有電噴霧離子源(ESI-)，質(zhì)譜檢測參數(shù)：ESI-掃描，離子源溫度550 ℃，離子噴射電壓為-4500 V；氣簾氣體(Cur)為30 p.s.i，碰撞氣(CAD)為9 p.s.i，多反應(yīng)檢測模式(MRM)，卡培他濱監(jiān)測離子對(m/z)358.2→153.9，5-氟尿嘧啶監(jiān)測離子對(m/z)129.1→42.1。

2.3 對照品溶液的配制

取卡培他濱、5-氟尿嘧啶對照品各約100 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加二甲基亞砜2 mL，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度約為2.0 mg/mL的儲備液，4 ℃避光保存。精密量取儲備液適量，用甲醇逐級稀釋，配制濃度為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、10.0、5.0、2.5和1.0 μg/mL的系列混標(biāo)溶液。

2.4 血漿樣本的制備

分別取200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、10.0、5.0、2.5和1.0 μg/mL的系列混標(biāo)溶液各20 μL，分別加到180 μL空白血漿中，配制終濃度為20 000、10 000、5 000、2 500、1 250、1 000、500、250和100 ng/mL的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，儲存于-20 ℃冰箱。

2.5 樣本處理方法

取大鼠血漿200 μL，加入甲醇600 μL，渦旋3 min，混合均勻；4 ℃，13 000 rpm，離心20 min后，取上清10 μL，加入超純水90 μL，0.22 μm濾膜過濾。

2.6 提取回收率試驗

取大鼠空白血漿180 μL三份，配制低、中、高三個濃度(10 000，1 250，250 ng/mL)樣品，每一濃度進行6樣本分析，得血漿樣品中卡培他濱、5-氟尿嘧啶的峰面積。

另取空白血漿180 μL三份，按2.5“樣本處理方法”項下操作至“13 000 rpm，離心20 min”，取上清，分別加入卡培他濱、5-氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液(100.0、12.5、2.5 μg/mL)20 μL，渦旋混勻，取10 μL，加入超純水90 μL，0.22 μm濾膜過濾，制成低、中、高三個濃度(10 000，1 250，250 ng/mL)的樣品，每一濃度進行3樣本分析，記錄色譜圖，得卡培他濱、5-氟尿嘧啶的峰面積，取平均值。以每一濃度兩種處理方法峰面積之比計算提取回收率。

2.7 醫(yī)用電子直線加速器單次照射大鼠損傷模型建立

SD大鼠10%水合氯醛麻醉并固定，X射線模擬機進行定位，照射部位為劍突與后肢之間，身體其他部位用鋁板遮蔽。直線加速器6 MeV電子線照射，劑量率3 Gy/min，單次照射10 Gy。

2.8 在體腸單向灌流

實驗前大鼠禁食12小時，正常飲水，麻醉并固定，沿腹中線打開腹腔約3 cm，對需要考察的腸段于兩端剪切后插管，將灌注管和引流管分別插入十二指腸、小腸、結(jié)腸等不同部位的近端和遠(yuǎn)端，結(jié)扎。

手術(shù)完成后，將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，保溫。先用37 ℃生理鹽水將腸內(nèi)容物沖洗干凈，穩(wěn)定后泵入空氣，將腸道內(nèi)剩余液體排盡。蠕動泵將含有所研究藥物的溶液以一定的速度灌入腸腔，收集流出液，LC-MS檢測流入與流出液中卡培他濱濃度。

實驗結(jié)束后，將大鼠處死，輕柔的將被考察的腸段剪下，在37 ℃生理鹽水浸潤下剪開腸段，用手術(shù)絲線附著法測量其長度(l)和內(nèi)半徑(r)，重量法計算藥物吸收速率常數(shù)(Ka)和藥物表觀吸收系數(shù)(Papp)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠單次照射腹腔損傷模型

大鼠腹腔單次照射后6～8天，與對照組比較，照射組均觀察到攝食、飲水量減少，體重降低，蜷縮少動，糞便稀軟甚至血便。分別取對照組和照射組腸組織制片病理觀察，與對照組比較，照射組表現(xiàn)為固有層腺體輪廓欠完整，結(jié)構(gòu)紊亂，排列稀疏，黏膜下炎細(xì)胞浸潤，多灶潰瘍形成。

3.2 色譜-質(zhì)譜方法學(xué)驗證

3.2.1專屬性

5-氟尿嘧啶的保留時間為1.947 min，卡培他濱的保留時間為19.025 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾5-氟尿嘧啶和卡培他濱的測定，方法的專屬性良好。

3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

以待測物濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)(X)，待測物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸運算，求得卡培他濱標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.853X-51.58(R2=0.990)，5-氟尿嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=2.41X+683.5(R2=0.993)，結(jié)果表明，卡培他濱和5-氟尿嘧啶在100～20 000 ng/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

3.2.3定量下限、準(zhǔn)確度和精密度

按信噪比S/N≈10確立定量限，測得血漿中卡培他濱、5-氟尿嘧啶的定量下限均為100 ng/mL，RSD值分別為16.8%和17.9%?？ㄅ嗨麨I、5-氟尿嘧啶的血漿樣本批間準(zhǔn)確度和精密度良好，均可滿足實驗要求。

3.2.4提取回收率

卡培他濱和5-氟尿嘧啶提取回收率結(jié)果見表1。由表1可見，卡培他濱、5-氟尿嘧啶血漿樣品的平均提取回收率分別為82.5%和94.9%，均可滿足實驗要求。

表1 卡培他濱和5-氟尿嘧啶提取回收率

3.3 血藥濃度-時間曲線

對照組與照射組大鼠分別單次灌胃500 mg/kg卡培他濱后血藥濃度-時間關(guān)系見圖1。

圖1 大鼠單次灌胃500 mg/kg卡培他濱后卡培他濱及5-氟尿嘧啶平均血藥濃度-時間曲線

經(jīng)WinNonlin軟件處理后，采用非房室模型求算大鼠血漿中卡培他濱及5-氟尿嘧啶的藥代動力學(xué)參數(shù)，包括半衰期(t1/2)、清除率(ClF)、表換分布容積(VzF)、從給藥時間開始到最后一個點時間的藥時曲線下面積(AUClast)、從給藥時間開始到理論外推無窮遠(yuǎn)的藥時曲線下面積(AUCINF)、達峰時間(Tmax)、達峰濃度(Cmax)等，結(jié)果列于表2。

表2 卡培他濱和5-氟尿嘧啶藥動學(xué)參數(shù)

結(jié)果可見，與對照組相比，單次灌胃給藥后，照射組卡培他濱和5-氟尿嘧啶均出現(xiàn)血藥濃度降低，Tmax延遲，Cmax降低，清除率加快，表觀分布容積略有增加，但兩組間消除t1/2未見顯著差異，說明直線加速器腹部局部10 Gy單次照射能抑制卡培他濱在腸道吸收進入血液循環(huán)，達峰時間推遲，峰濃度和血藥濃度降低，同時排泄加快；然而沒有影響卡培他濱的代謝速率。

3.4 在體腸單向灌流卡培他濱腸吸收情況

Pin/Pout分別為進口處和出口處灌流液中藥物的質(zhì)量濃度，分別比較十二指腸、小腸和結(jié)腸中卡培他濱吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀吸收系數(shù)(Papp)，參數(shù)列于表3。結(jié)果表明，10 Gy單次照射后，照射組小腸和結(jié)腸部分的Ka和Papp均低于對照組。

表3 卡培他濱腸灌流吸收速率常數(shù)和表觀吸收系數(shù)

4 討論

本實驗所建立的UPLC-MS/MS分析方法操作簡單、可重復(fù)性高，能同時測定大鼠血漿樣品中原型藥物卡培他濱及活性代謝物5-氟尿嘧啶。

大鼠10 Gy單次照射，腸組織病理表現(xiàn)為固有層腺體輪廓欠完整，結(jié)構(gòu)紊亂，排列稀疏，黏膜下炎細(xì)胞浸潤，多灶潰瘍形成。腹部放療直接破壞腸道組織DNA雙鏈，或者產(chǎn)生氧自由基，間接破壞DNA結(jié)構(gòu)，阻斷DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程，造成腹盆腔放射性損傷，特別是放射性腸粘膜損傷，主要表型為炎癥、潰瘍等[1-3]。

卡培他濱在腸道透膜吸收，同時代謝生成5-氟尿嘧啶，從本試驗結(jié)果可知，直線加速器腹部局部10 Gy單次照射可抑制卡培他濱在腸道吸收進入血液循環(huán)，使大鼠體內(nèi)卡培他濱的清除率增加、血藥濃度降低、Cmax降低。此外，放療損傷腸道機械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障及生物屏障，引起腸道病態(tài)條件下結(jié)構(gòu)/功能(腸粘膜損傷、腸通透性增加、腸道菌群失調(diào)等)的改變，以結(jié)腸、小腸最為敏感[4-6]。在體腸單向灌流顯示，10 Gy單次照射導(dǎo)致結(jié)腸、小腸部位的Ka和Papp顯著降低，這也與文獻報道一致。研究認(rèn)為患者放療引起的腸道損傷影響卡培他濱在腸道組織的吸收，改變體內(nèi)過程，可能是增加其毒副作用的機制之一。

5 結(jié)語

輻射能導(dǎo)致機體產(chǎn)生炎癥、潰瘍等反應(yīng)，損傷腸道的機械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障及生物屏障，同時也能導(dǎo)致藥物在機體的代謝動力學(xué)特征發(fā)生顯著改變。臨床開展放療和化療聯(lián)合治療時，應(yīng)注意放療引起的組織損傷等毒副作用，同時關(guān)注機體對藥物的代謝變化，并據(jù)此合理設(shè)計給藥方案，以盡可能降低放療引起的照射不良反應(yīng)[7-11]。