郭劍平,張華屏,周朝東,楊仲田

(1.中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP中心，太原，030006；2.山西醫(yī)科大學(xué)，太原,030001；3.中國(guó)輻射防護(hù)研究院, 太原，030006)

殼聚糖是自然界廣泛存在的甲殼素經(jīng)脫乙?；玫降漠a(chǎn)物，是天然多糖中唯一的堿性多糖。小于20個(gè)單糖的殼聚糖稱為低聚殼聚糖。有研究表明低聚殼聚糖具有抗輻射損傷作用[1-2]，并且毒性極低。本文從組織、細(xì)胞、蛋白和基因表達(dá)水平探討低聚殼聚糖的輻射損傷防護(hù)效果及機(jī)理，為篩選高效、低毒的輻射防護(hù)藥物提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 低聚殼聚糖

以食品級(jí)大分子殼聚糖為原料，敏化劑協(xié)同作用，經(jīng)輻照降解氧化后制備而成。分子量<2 kD，分散系數(shù)1.21。使用前用蒸餾水配制成溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周雄性清潔級(jí)SX1近交系小鼠，山西省腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)：SCXK(晉)2007-001。

1.3 輻照源

60Co γ源，活度1.2×1015Bq，中國(guó)輻射防護(hù)研究院鈷源房。

1.4 主要儀器和試劑

1.4.1儀器

BD FACSAria型流式細(xì)胞儀，貝克曼公司；轉(zhuǎn)印槽/伯樂(lè)轉(zhuǎn)膜儀，BIO-RAD，Trana-Blot；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)試劑，BIO-RAD；化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)，Chemi Doc XRS。

1.4.2試劑

凋亡試劑盒(Annexin V-FITC)，凱基公司，國(guó)產(chǎn)；beta-actin抗體，sc-47778，Santa Cruz Biotechnology；P53抗體:sc-73566，Santa Cruz Biotechnology。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

2.1 小鼠30天存活率

實(shí)驗(yàn)小鼠按給藥濃度隨機(jī)分5組，每組10只，口服灌胃，給藥劑量為0(單純照射組)、200、300、400和500 mg/kg，每天給藥1次，連續(xù)14天，給藥第7天對(duì)小鼠進(jìn)行全身照射，吸收劑量7 Gy，劑量率70 cGy/min。觀察不同處理組30天小鼠存活情況，統(tǒng)計(jì)30天存活率、平均存活天數(shù)，計(jì)算保護(hù)指數(shù)[3]。

保護(hù)指數(shù)≥1.2為有保護(hù)作用。

2.2 骨髓有核細(xì)胞數(shù)

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、低聚殼聚糖組(300 mg/kg)，每組10只。連續(xù)灌服低聚殼聚糖21天，每天1次。正常對(duì)照組和單純照射組灌服蒸餾水。給藥第7天后兩組小鼠均接受3.5 Gy60Co γ射線全身照射，劑量率0.5 Gy/min。照射后第14天取小鼠股骨，用1 mL白細(xì)胞稀釋液沖出骨髓液，并調(diào)整細(xì)胞濃度，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)。

2.3 骨髓細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、低聚殼聚糖組(300 mg/kg)，每組6只。給藥第14天后兩組小鼠接受5 Gy60Co γ射線全身照射，劑量率0.5 Gy/min。

照射后6、12、24和48 h取出兩大腿股骨，用PBS液沖出骨髓細(xì)胞，混勻。處理并調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，按試劑盒說(shuō)明方法染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞率[4]。

2.4 脾臟器系數(shù)

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、低聚殼聚糖組(300 mg/kg)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組40只。連續(xù)灌服低聚殼聚糖14天，每天1次。正常對(duì)照組和單純照射組灌服蒸餾水。給藥第14天后兩組小鼠均接受7 Gy60Co γ射線全身照射，劑量率0.33 Gy/min。在照后第5、10、15、20、30天，各組分別取5只存活小鼠脾臟，稱取并記錄脾臟重量。

2.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、低聚殼聚糖組(300 mg/kg)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只。給藥第14天后兩組小鼠接受5 Gy60Co γ射線全身照射，劑量率0.5 Gy/min。

照射后6 h，摘取動(dòng)物脾臟，每個(gè)脾組織分別進(jìn)行RT-PCR方法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3，以GAPDH為參照，Photoshop 7.0分析條帶。各基因RT-PCR試驗(yàn)條件見(jiàn)表1。

表1 各基因RT-PCR試驗(yàn)條件一覽表

2.6 細(xì)胞P53蛋白質(zhì)、Gadd45蛋白質(zhì)

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組、低聚殼聚糖組(300 mg/kg)，每組10只。給藥第14天后兩組小鼠接受5 Gy60Co γ射線全身照射，劑量率0.5 Gy/min。照射后6 h，摘取動(dòng)物脾臟，用Western blot方法檢測(cè)P53蛋白質(zhì)和Gadd45蛋白質(zhì)。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

用卡方檢驗(yàn)對(duì)30天存活率進(jìn)行檢驗(yàn)，用t檢驗(yàn)對(duì)兩樣本均數(shù)差別的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。

3 結(jié)果和討論

3.1 結(jié)果

3.1.130天存活率

不同濃度低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠30天存活率、平均存活時(shí)間和保護(hù)指數(shù)的影響檢測(cè)結(jié)果列于表2。

表2 不同濃度低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠30天存活率、存活天數(shù)、保護(hù)指數(shù)的影響

由表2可見(jiàn)，與單純照射組相比，各低聚殼聚糖組(200～500 mg/kg)的小鼠30天存活率分別提高20%、30%、20%和10%，平均存活時(shí)間差異顯著，其中300 mg/kg組在各組中的30天存活率、平均存活天數(shù)和保護(hù)指數(shù)最高(保護(hù)指數(shù)≥1.2為有效)。故后期試驗(yàn)采用的藥物濃度均為300 mg/kg(稱為“低聚殼聚糖組”)。

3.1.2有核細(xì)胞數(shù)和骨髓細(xì)胞凋亡

低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)和骨髓細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果列于表3和表4。由表3可見(jiàn)，低聚殼聚糖組骨髓有核細(xì)胞數(shù)顯著高于單純照射組。由表4可見(jiàn)，低聚殼聚糖組的凋亡細(xì)胞下降，6～12 h變化較大，與單純照射組相比差異顯著。

表3 低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響

表4 低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的影響

3.1.3脾臟器系數(shù)

低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠不同時(shí)間脾臟臟器系數(shù)的影響結(jié)果列于表5。由表5可見(jiàn)，低聚殼聚糖組照射后第5～20天，脾臟器系數(shù)值有緩慢上升趨勢(shì)，與單純照射組相比差異顯著。

表5 低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠不同時(shí)間脾臟臟器系數(shù)的影響

3.1.4脾臟凋亡基因

低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠6 h脾臟凋亡基因的影響變化情況列于表6。由表6可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，低聚殼聚糖組凋亡相關(guān)基因Caspas-3下調(diào)，Bax上調(diào)，Bcl-2上調(diào)，Bcl-2/Bax比值提高，比值高于1；與單純照射組相比差異顯著。

表6 低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠6 h脾臟凋亡基因變化情況

3.1.5P53蛋白質(zhì)、Gadd45蛋白質(zhì)表達(dá)

圖1為 Western blot方法檢測(cè)P53、Gadd45蛋白結(jié)果。低聚殼聚糖對(duì)受照小鼠脾臟P53蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響見(jiàn)圖2(a)，對(duì)Gadd45蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響見(jiàn)圖2(b)。由圖2可見(jiàn)，與單純照射組相比，低聚殼聚糖組的蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。

圖1 Western blot方法檢測(cè) P53、Gadd45蛋白結(jié)果

圖2 低聚殼聚糖對(duì)受照動(dòng)物脾臟P53、Gadd45蛋白表達(dá)的影響

3.2 討論

電離輻射能夠引起機(jī)體組織器官的嚴(yán)重?fù)p傷，而機(jī)體的各個(gè)組織器官對(duì)輻射的敏感性是有差異性的，其中骨髓是機(jī)體重要的中樞免疫及造血器官，脾臟是機(jī)體重要免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，同時(shí)脾臟也是機(jī)體血液儲(chǔ)存的重要器官。

小鼠受到照射后，骨髓有核細(xì)胞數(shù)降低，但低聚殼聚糖組有核細(xì)胞數(shù)顯著提高。5 Gy照射后骨髓細(xì)胞凋亡發(fā)生在6～12 h，24 h后下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。與單純照射組相比，低聚殼聚糖組6～12 h凋亡細(xì)胞發(fā)生數(shù)明顯下降，表明低聚殼聚糖能夠抑制輻射引起的細(xì)胞凋亡，減少由于照射造成的骨髓細(xì)胞損失，有效保護(hù)骨髓細(xì)胞的造血功能，具有一定的輻射防護(hù)作用。

低聚殼聚糖組小鼠脾臟器系數(shù)在照后20天內(nèi)變化不大，到30天時(shí)，接近正常對(duì)照組。低聚殼聚糖在動(dòng)物照射損傷后，調(diào)節(jié)脾臟相關(guān)凋亡基因表達(dá)，最后表現(xiàn)出降低脾臟臟器系數(shù)的減少，對(duì)受損動(dòng)物免疫功能的恢復(fù)起到積極的作用。

細(xì)胞凋亡是影響細(xì)胞輻射敏感性的重要事件，減少細(xì)胞凋亡，保持細(xì)胞存活是輻射損傷防治的重要措施之一。P53在損傷細(xì)胞存活中起重要作用并因此被譽(yù)為“基因警察”。本實(shí)驗(yàn)單純照射組P53蛋白質(zhì)增加，而低聚殼聚糖組P53蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，說(shuō)明低聚殼聚糖對(duì)輻射所致的P53蛋白質(zhì)表達(dá)水平有抑制作用。

P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制是通過(guò)Bax/Bcl-2這一比值的轉(zhuǎn)換而完成。Bcl-2和Bax是一對(duì)關(guān)系密切的凋亡基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用。Bcl-2抑制細(xì)胞的凋亡，Bax則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2/Bax比例對(duì)決定細(xì)胞命運(yùn)起著關(guān)鍵的作用。當(dāng)Bcl-2/Bax比值>1時(shí)，細(xì)胞凋亡無(wú)明顯增加；而B(niǎo)cl-2/Bax比值<1時(shí)，細(xì)胞凋亡增加明顯。本實(shí)驗(yàn)中低聚殼聚糖組促凋亡基因Bax、Caspas-3表達(dá)均下調(diào)，抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值>1，與單純照射組相比有差異顯著。表明低聚殼聚糖有抑制輻射損傷小鼠脾組織細(xì)胞凋亡的作用。研究表明，DNA損傷使P53蛋白活力上升，P53通過(guò)對(duì)Bcl-2和Bax表達(dá)的調(diào)節(jié)，降低細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因素的耐力[6]?？梢?jiàn)，P53能同時(shí)在mRNA水平激活Bax基因的表達(dá)和抑制bcl-2基因的表達(dá)。P53誘導(dǎo)凋亡可能部分通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2的比例得以實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中單純照射組結(jié)果與以上結(jié)論相同。低聚殼聚糖抑制P53蛋白表達(dá)，通過(guò)誘導(dǎo)凋亡，在mRNA水平激活Bcl-2基因的表達(dá)和抑制Bax基因的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax的比例，提高細(xì)胞對(duì)凋亡刺激因素的耐力，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的減少，抑制了DNA損傷對(duì)細(xì)胞的凋亡作用。

Gadd45是一個(gè)生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷基因，是P53下游靶基因。Gadd45可以通過(guò)P53依賴及非依賴兩條途徑被誘導(dǎo)表達(dá)增高，參與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)以及信號(hào)傳導(dǎo)等重要細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)[7-8]。在電離輻射的作用下，Gadd45可以通過(guò)P53依賴的方式表達(dá)上調(diào)。研究表明，高劑量X射線照射可引起P53蛋白增多誘導(dǎo)Gadd45增加[9]，本實(shí)驗(yàn)單純照射組Gadd45、P53蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高，與研究結(jié)果一致。但低聚殼聚糖組Gadd45、P53蛋白質(zhì)表達(dá)水平均有降低趨勢(shì)。

低聚殼聚糖間接參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等重要細(xì)胞生命活動(dòng)的積極調(diào)控，減少由于照射引起的造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞數(shù)量損失，并維持其功能的實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致動(dòng)物存活率的提高。低聚殼聚糖提高存活率的影響因素很多，其中抑制細(xì)胞凋亡是有效因素之一。

本研究結(jié)果證實(shí)低聚殼聚糖具有輻射損傷保護(hù)作用，它可能通過(guò)抑制P53蛋白、GADD45蛋白質(zhì)水平表達(dá)，影響凋亡相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)骨髓和脾臟細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)，從而有效提高了受到致死劑量γ射線照射小鼠的30天存活率。

4 結(jié)語(yǔ)

核能屬于清潔能源，隨著人類對(duì)核能利用的日趨廣泛，對(duì)輻射損傷機(jī)制和防護(hù)藥物的研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，開(kāi)發(fā)高效、低毒的理想抗輻射損傷藥物就變得尤為重要。氨磷汀(WR2721)作為唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的輻射防護(hù)劑，可通過(guò)清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧、保護(hù)DNA及促進(jìn)DNA損傷修復(fù)等機(jī)制發(fā)揮輻射防護(hù)特性，但毒副作用較大，且臨床效果不盡人意。大多數(shù)傳統(tǒng)的輻射防護(hù)劑不良反應(yīng)較大、防護(hù)時(shí)間窗較窄及給藥途徑受限等,臨床仍缺乏理想的抗輻射藥物。低聚殼聚糖來(lái)源廣泛，制備技術(shù)成熟，不僅具有良好的生物降解性，還有良好的生物相容性以及生物粘附性，其降解產(chǎn)物無(wú)毒性，無(wú)免疫原性，可以考慮作為輻射防護(hù)劑并進(jìn)行更深入的開(kāi)發(fā)研究。初步證明低聚殼聚糖具有一定的輻射損傷保護(hù)作用，藥物的防護(hù)作用機(jī)理研究將在今后的工作中進(jìn)一步探討。