劉元林，田曉靜,2，黃匯惠，柏家林,2，丁功濤,2，孫 娜,2，馬忠仁,2，馬占龍

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.臨夏市俊林清真肉制品有限責任公司,甘肅 臨夏 731100)

我國是世界上牦牛數(shù)量最多的國家，主要分布在西北地區(qū)，以散戶養(yǎng)殖方式為主[1-2]，2019年，全國屠宰牦牛約360萬頭[3].牦牛血液是屠宰過程中產(chǎn)生的最多副產(chǎn)品之一，也是一種優(yōu)質的動物血資源，但其有較重的血腥味、消化性和適口性差、色澤感官不佳且原料血液極難保存等因素，嚴重制約著牦牛血資源的綜合利用，造成資源浪費和環(huán)境污染[4]等問題.畜禽血液的開發(fā)已經(jīng)運用到食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多個領域[5-6]，如將豬血血球蛋白酶解液與氧化豬脂等原料進行熱反應制備豬肉香精[7]；烏雞血脫色后仍保留一定的抗血栓功能作用[8]；鴨血制備高亞鐵鰲合能力的酶解產(chǎn)物[9]；駝血制備抗氧化和降糖活性肽[10]；雞血發(fā)酵液體肥料可提高小白菜種子發(fā)芽率，降低硝酸鹽，增加Vc含量[11]等.

目前，對牦牛血資源利用已有一定研究，如將牦牛血制作益生菌發(fā)酵牦牛血腸[12]；用酶解法將牦牛血紅蛋白水解成易于吸收的小肽或氨基酸來生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，如牦牛血紅蛋白粉[13]、氯化血紅素[14]及補血營養(yǎng)品等[15]，從而提高生產(chǎn)產(chǎn)品的高附加值.獲得高質量水解液成為生產(chǎn)的關鍵點.蛋白水解方法主要有酸水解、堿水解、酶水解以及微生物發(fā)酵等[16].酸、堿水解在一定程度上降低氨基酸質量[17]；酶水解反應條件溫和；微生物發(fā)酵對菌要求較高，發(fā)酵細菌的培養(yǎng)過程十分漫長和復雜.酶處理血液資源成為目前研究的熱點.利用水解獲得豐富的氨基酸、肽類資源，可提高牦牛血資源利用率.

本文采用單因素試驗研究風味蛋白酶的水解pH、溫度、料液比、酶濃度、時間對牦牛血液蛋白水解率的影響規(guī)律，并采用五因素三水平正交試驗優(yōu)化水解工藝，以期為綜合利用牦牛血液資源提供技術支持，也為開發(fā)牦牛血氨基酸產(chǎn)品提供基礎研究.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛血采于甘肅省臨夏市俊林清真肉制品有限責任公司，經(jīng)粗濾后運至實驗室.

L-8900全自動氨基酸分析儀(日本Hitachi公司)；LGJ-100F真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；FOSS scrubber 2501福斯蛋白質消化儀(福斯中國有限公司)；S2-Field Kit便攜式pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；L3S可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司).

風味蛋白酶(山東隆科特酶制劑有限公司(10萬U/g))；L-酪氨酸、福林試劑(北京索萊寶科技有限公司)；乙酸、硫酸、無水乙酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸鉀、對硝基苯酚、三氯乙酸均為分析純(煙臺市雙雙化工有限公司)；甲醛(36%～38%)為分析純(天津市百世化工有限公司).

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

采集的新鮮牦牛血液放入真空冷凍干燥機，在-45 ℃預凍2 h后，于0.01 Pa真空度下采用-40 ℃～25 ℃線性降溫、升溫的方法，將血液凍干成血粉(血粉得率為22.41±0.01%).過80目篩，除去毛、碎肉等雜物，自封袋封存于冰箱-4 ℃保存.

1.2.2 單因素試驗設計

蛋白水解效果會受料液比、酶濃度、水解pH、水解時間、水解溫度等因素的影響.本研究以蛋白水解率為指標，通過單因素試驗研究風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白的料液比(1︰3.0、1︰4.5、1︰6.0、1︰7.5、1︰9.0 g·mL-1)、酶濃度(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%)、水解時間(2、3、4、5、6 h)、水解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、水解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對牦牛血液蛋白水解效果的影響規(guī)律.實驗過程中每隔30 min以1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH至設定值.

1.2.3 正交試驗設計

在單因素實驗基礎上，采用L18(37)進行5因素3水平的正交試驗優(yōu)化風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白的工藝，正交實驗因素水平設計見表1.

表1 正交試驗因素水平表

1.2.4 酶活力測定

參照GB/T 23527-2009蛋白酶制劑[18]中的福林法檢測酶活，于680 nm波長下測風味蛋白酶試樣的吸光值，以酪氨酸濃度為x軸，吸光值為y軸繪制標準曲線，回歸曲線為y=0.0104x-0.0072，R2=0.9987，線性結果良好.

1.2.5 蛋白質含量的測定

參照GB 5009.5-2016食品安全國家標準食品中蛋白質的凱氏定氮法[19]，測牦牛血粉總蛋白含量平行樣3次，以平均值計算.

1.2.6 蛋白水解率的測定

采用甲醛滴定法檢測氨基酸含量，蛋白水解率[20]計算公式如下：

DH=(N-N0)/(Nt-N0)×100

式中：DH為蛋白水解率，%；N0為未水解樣品中游離氨基酸的含量，%；N為水解液中氨基酸的含量，%；Nt為底物蛋白中的總氮的含量，%.

1.2.7 氨基酸含量的測定

樣品處理：樣品液中加入5%的5-磺基水楊酸，1 200 rpm/min離心15 min，去除蛋白后取上清液，使用全自動氨基酸分析儀檢測水解產(chǎn)物中的游離氨基酸.

色譜條件：色譜柱4.6×60 mm磺酸型陽離子樹脂，分離柱柱溫50 ℃，反應柱柱溫135 ℃，進樣體積為10 μL.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(one-way-analysis of variance，one-way-ANOVA)進行顯著性分析，由SPSS V17完成.試驗結果圖由Origin 8.0軟件(美國OriginLab公司)繪制.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結果如圖1(A)所示，當料液比在(1︰3.0～1︰7.5) g·mL-1時，蛋白水解率不斷上升；料液比為1︰7.5 g·mL-1時，蛋白水解率最大.之后蛋白水解率隨料液比減少而降低.料液比在一定范圍內能影響風味蛋白酶對牦牛血液蛋白的水解率，濃度過高過低都會使水解效率降低，選取較佳料液比為1︰7.5 g·mL-1.

A:料液比；B:酶濃度；C:水解pH；D:水解時間；E:水解溫度

2.1.2 酶濃度對風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結果如圖1(B)所示，隨酶濃度逐漸增加，蛋白水解率也在增大.酶濃度在0.25%～0.75%時，蛋白水解率增加趨勢較快；酶濃度在0.75%～1.25%時，蛋白水解率增加趨勢變平緩.經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，1.00%酶濃度與1.25%酶濃度的蛋白水解率差異不顯著(P≥0.05).綜合考慮蛋白水解率與成本，選取較佳酶濃度為1.00%.

2.1.3 pH對風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結果如圖1(C)所示，在pH為6.0～6.5范圍內蛋白水解率明顯上升；pH為6.5時牦牛血液蛋白水解率達到最大；之后蛋白水解率不斷下降，選取較佳pH為6.5.

2.1.4 水解時間對風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結果如圖1(D)所示，隨水解時間的延長，蛋白水解率持續(xù)增加，其中2～4 h增加趨勢較快，水解5 h與6 h的蛋白水解率差異不顯著(P≥0.05).綜合考慮蛋白水解率與時間成本，選取較佳水解時間為5 h.

2.1.5 水解溫度對風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影響

結果如圖1(E)所示，溫度過低會降低酶活性，過高會使酶失活.隨溫度的升高蛋白水解率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在50 ℃時牦牛血液蛋白水解率最高，選擇較佳水解溫度為50 ℃.

2.2 正交試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，以水解pH、水解溫度、料液比、酶濃度、水解時間為因素，以蛋白水解率為指標，采用五因素三水平正交實驗優(yōu)化，其設計見表2.

表2 正交試驗極差分析

在單因素試驗基礎上，以水解pH、水解溫度、料液比、酶濃度、水解時間為因素，以蛋白水解率為指標，采用五因素三水平正交實驗優(yōu)化，結果由極差分析(表2)和方差分析(表3)可知，五個因素對牦牛血液蛋白水解的影響都存在顯著性.極差分析影響順序依次為水解pH(A)>酶濃度(D)>水解時間(E)>料液比(C)>水解溫度(B)；方差分析為水解pH(A)>酶濃度(D)>水解時間(E)>水解溫度(B)>料液比(C)，即水解pH的影響最大，為主要因素；其次是酶濃度與水解時間，水解溫度與料液比的影響較小.較佳水解工藝參數(shù)為A1B2C3D3E3，即水解pH為6.0、水解溫度50 ℃、料液比1︰9.0 g·mL-1、酶濃度1.25%、水解時間6 h，此時蛋白水解率為33.42±0.44%.

赫玉蘭等人[15]以牛血紅蛋白為原料比較不同酶的水解效果，發(fā)現(xiàn)酶種類對水解效果有顯著影響(P<0.05).韓學燕等人[21]利用中性蛋白酶水解牦牛血紅蛋白水解，在pH為7.0、溫度45 ℃、酶底物濃度比6 000 U/g、底物濃度5%、水解時間5 h條件下，蛋白水解率為31.32%.付彩霞[22]探究風味蛋白酶水解鹿血時較佳溫度為50 ℃，最適起始pH為6.5.本實驗優(yōu)化結果與其相近，而文獻[22]中先用4 500 U/g堿性蛋白酶在底物濃度8%、起始pH值8.0、反應溫度55 ℃條件下水解鹿血1 h，接著加入1 500 U/g風味蛋白酶水解3 h，所得的鹿血酶解產(chǎn)物的水解度為27.95%.與上述研究相比，本實驗酶添加量高、酶解時間長，水解率也稍高.為獲得更加豐富的小分子肽及游離氨基酸，江霞等人[23]在風味蛋白酶與胰酶比例(0.96︰1)，水解溫度50.88 ℃，初始pH為8.15，底物濃度6%，水解時間6 h的條件下酶解豬血蛋白水解率為43.13%.在相近的酶解時間與酶解溫度下，復酶水解率高于單酶.為提高水解率，后續(xù)實驗可考慮酶的復配工藝.

表3 正交試驗方差分析

2.3 牦牛血液蛋白水解液氨基酸結果

表4 風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白氨基酸結果

為進一步探究優(yōu)化的風味蛋白酶水解工藝對牦牛血液蛋白的水解效果，采用全自動氨基酸分析儀檢測水解液中氨基酸的種類與含量，結果見表4.

氨基酸種類與含量在一定程度上直接決定了水解液的質量，牦牛原血與牦牛血液蛋白水解液氨基酸結果見表4.從表4可以看出，優(yōu)化后的風味蛋白酶水解工藝在一定程度上提高了氨基酸質量，其中亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、丙氨酸的含量提高較多；鳥氨酸、脯氨酸、氨基丁酸的含量提高較少；水解液中新增添了天冬氨酸與谷氨酸.牦牛原血氨基酸總量為25.52 mg/100 mL.經(jīng)風味蛋白酶水解后氨基酸總量為4 454.20 mg/100 mL.蛋白水解液的氨基酸總量是牦牛原血的氨基酸總量的174倍.由此可見，本實驗優(yōu)化后的水解工藝參數(shù)較理想.牦牛血酸水解氨基酸總量為20 051.75 mg/100 mL，氨基酸總量是風味蛋白酶水解液的4.5倍.但高溫強酸的條件在一定程度上會破壞部分氨基酸，酸水解液中未檢測到氨基丁酸、鳥氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸.酶水解條件較溫和，水解液中氨基酸種類較齊全.后期對水解液的處理工藝較簡單，一定程度上反映出酶水解的優(yōu)勢.

3 結論

為提高牦牛血液蛋白水解率，采用單因素實驗和五因素三水平正交實驗優(yōu)化風味蛋白酶水解牦牛血液蛋白工藝.單因素實驗發(fā)現(xiàn)，隨料液比不斷減小，蛋白水解率先上升后下降.隨酶濃度逐漸增加，蛋白水解率也增大，之后增加趨勢變平緩.當水解pH不斷變大，蛋白水解率呈先上升后下降的規(guī)律.水解時間越長，蛋白水解率持續(xù)增大；水解溫度不斷升高，蛋白水解率呈現(xiàn)先上升后降低的規(guī)律.通過正交實驗確定較佳的水解條件為A1B2C3D3E3，水解pH為6.0、水解溫度50 ℃、料液比1︰9.0 g·mL-1、酶濃度1.25%、水解時間6 h.此時蛋白水解率為33.42±0.44%，且水解液氨基酸總量是牦牛原血氨基酸總量的174倍.該方法為合理利用畜禽血液資源進行生物產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)提供技術支持.