李 菊，和偉程，柏家林

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)通過呼吸道和消化道感染引起的一種急性傳染病，短時(shí)間內(nèi)可侵襲所有重要器官[1].PPRV主要感染山羊和綿羊，導(dǎo)致極高的發(fā)病率和死亡率，中亞地區(qū)的瀕危動(dòng)物賽加羚羊也深受影響[2-3].根據(jù)PPRV 核衣殼(Nucleocapsid protein,N)蛋白和融合(Fusion protein,F)蛋白基因的部分序列，將其分為4個(gè)譜系，但發(fā)病早期病毒致病性沒有譜系特異性差異[4].該病的潛伏期一般為4～6天，早期感染在局部淋巴組織中[5]，感染后5～10天傳染性最強(qiáng)[6]，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、白細(xì)胞減少及排泄物增多等，通過組織學(xué)檢測可在病畜脾臟、淋巴結(jié)和胸腺中檢測到糜爛性壞死.PPR的實(shí)驗(yàn)室確診需通過病毒分離、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)和病毒中和試驗(yàn)(Virus neutralization test,VNT)三個(gè)金標(biāo)準(zhǔn).在資源有限的環(huán)境下，側(cè)流裝置(Lateral-flow device,LFD)和逆轉(zhuǎn)錄重組聚合酶擴(kuò)增(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)檢測技術(shù)可為檢測PPRV提供一個(gè)簡單、快速、可靠的檢測平臺(tái).有人認(rèn)為進(jìn)行PPRV分子診斷時(shí)鼻拭子是首選標(biāo)本[7-8].

PPRV 于1942年首次在西非的科特迪瓦被發(fā)現(xiàn)，曾在非洲、中東和亞洲等地區(qū)流行并造成重大經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)列為未來15年必須消滅的跨界疫病.2007年在我國西藏首次爆發(fā)小反芻獸疫，2013—2014年間該病在我國22個(gè)省市流行開來[9-10]，2018年在我國甘肅西北部造成少量綿羊死亡[11]，由此PPRV疫苗的開發(fā)就顯得十分重要.

1 病毒分子結(jié)構(gòu)及流行病學(xué)

1.1 病毒分子結(jié)構(gòu)

PPRV是15 948個(gè)核苷酸組成的無節(jié)段單股負(fù)鏈有包膜的RNA病毒，由3'N、P、M、F、H和L5' 6個(gè)轉(zhuǎn)錄單元組成.根據(jù)開放閱讀框架和RNA編輯的不同，可編碼8種蛋白質(zhì)，包括核衣殼(N)蛋白、基質(zhì)(Matrix protein,M)蛋白、聚合酶(Large virus-specified RNA polymereasprotien,L)或大蛋白、磷(Phospho protein,P)蛋白、血凝素(Hemagglutinin protein,H)和融合(F)蛋白6種結(jié)構(gòu)蛋白以及2種非結(jié)構(gòu)蛋白C和V.N、P和L蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物(Ribonucleoprotein complex,RNP)包裹病毒RNA，形成大小為400～500 nm的包膜顆粒.兩個(gè)跨膜糖蛋白F和H位于病毒包膜上.在包膜的內(nèi)表面，M蛋白作為橋梁將F和H蛋白的胞質(zhì)尾部連接到RNP上.

1.2 流行病學(xué)

PPRV宿主廣泛，可在種內(nèi)和種間傳播和流行，除了典型宿主山羊和綿羊，在其他許多物種中也分離出了該病毒包括牛、駱駝、豬、狗和亞洲獅等.PPRV對(duì)山羊高度易感，致病率和死亡率可高達(dá)100%，但是PPRV的致病機(jī)制及傳染性與菌株的毒力和宿主的種類以及年齡等多種因素有關(guān)，如不同的山羊發(fā)病嚴(yán)重程度不同，死亡率也不盡相同，綿羊常表現(xiàn)為亞臨床癥狀，在PPRV的傳播中起著重要作用[12].牛和駱駝幾乎不表現(xiàn)出臨床癥狀，是PPRV的死胡同宿主[13-15].而豬和野豬有可能作為PPRV的傳染源[14]，對(duì)其他易感物種造成潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)，成為根除PPR的障礙.有研究表明，PPRV的宿主譜仍在逐漸擴(kuò)大[16-17].了解疾病流行地區(qū)PPRV在宿主中的流行特點(diǎn)，可為開發(fā)一種針對(duì)多種宿主有用的新型疫苗提供思路.

2 疫苗的開發(fā)

在麻疹病毒屬6個(gè)成員中，PPRV與牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)關(guān)系最近，在過去常用RPV減毒活疫苗來控制PPRV.隨著RPV的根除和無牛瘟區(qū)域策略的實(shí)施，RPV疫苗被禁用.根據(jù)RPV根除經(jīng)驗(yàn)，研究人員利用連續(xù)培養(yǎng)致弱的方法先后開發(fā)了4種減毒活疫苗，這幾種疫苗在流行地區(qū)取得不錯(cuò)的免疫成效，但PPRV減毒活疫苗無法區(qū)分自然感染動(dòng)物和接種動(dòng)物(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA)并且耐熱性低，導(dǎo)致PPR仍在很多地區(qū)相繼出現(xiàn)并造成重大的經(jīng)濟(jì)損失.雖然采用穩(wěn)定劑和冷凍干燥循環(huán)可提高其耐熱性[18]，但這也增加了疫苗生產(chǎn)成本，難以在PPR流行的發(fā)展中國家推行.因此耐熱的新型DIVA疫苗成為近年來的研究熱點(diǎn)，并在重組亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和聯(lián)合疫苗方面取得了一定的成就，滅活疫苗的開發(fā)也頗具進(jìn)展.

2.1 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗由病原功能性結(jié)構(gòu)蛋白制成，與傳統(tǒng)減毒活疫苗相比，此類疫苗安全性更高、免疫保護(hù)性更強(qiáng)，是PPRV根除運(yùn)動(dòng)中的候選疫苗.PPRV H和F是病毒的兩種主要抗原蛋白，H蛋白包含較多中和抗體表位和少數(shù)T細(xì)胞表位，主要誘導(dǎo)中和抗體的表達(dá);F蛋白包含許多T細(xì)胞表位，主要誘導(dǎo)特異性抗體表達(dá).這兩種蛋白均能激發(fā)保護(hù)性免疫抵抗PPRV的侵害[19]，是開發(fā)PPRV新型重組亞單位疫苗的良好靶蛋白.

Rojas等構(gòu)建了含PPRV F和H基因的重組復(fù)制缺陷型人5型腺病毒(Adenovirus 5,Ad5)，并將該重組病毒感染HEK293A細(xì)胞，獲得表達(dá)F或H蛋白以及同時(shí)表達(dá)F和H蛋白的兩種重組亞單位疫苗，用肌肉接種的方法兩次免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)PPRV特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答.攻毒試驗(yàn)也表明該疫苗可抵抗PPRV強(qiáng)毒株的攻擊，使綿羊免受PPRV的侵害[20-21].Herbert等也對(duì)該重組亞單位疫苗在山羊體內(nèi)的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明,單次接種Ad-H即可誘導(dǎo)高水平的病毒特異性抗體和中和抗體，能完全保護(hù)山羊免受強(qiáng)毒PPRV的攻擊[22]，阻斷病毒的傳播.Holzer等測定發(fā)現(xiàn),0.1PFU劑量的Ad疫苗即可保護(hù)東非山羊免受PPRV攻擊[23].Fakri等以羊痘病毒(Sheep and goat pox virus,SGPV)為載體表達(dá)H或F蛋白，或同時(shí)表達(dá)H和F蛋白產(chǎn)生重組山羊痘病毒.在山羊和綿羊身上進(jìn)行安全性和有效性評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn),同時(shí)表達(dá)H和F蛋白的重組SGPV疫苗對(duì)PPR有較早和較強(qiáng)的免疫力[24].最近，Murr等證實(shí)，表達(dá)F蛋白的重組新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗可以預(yù)防PPR，且具有DIVA疫苗適用性和高耐熱性[25]，值得深入研究.

以上研究表明,利用病毒載體制備的重組亞單位疫苗對(duì)羊群具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，同時(shí)符合新型DIVA疫苗開發(fā)原則，但重組亞單位疫苗不能長時(shí)間產(chǎn)生高水平抗體，因此，這類疫苗在有效保護(hù)周期上存在一定缺陷.

2.2 病毒樣顆粒疫苗

PPRV M蛋白可促進(jìn)病毒的組裝和釋放，當(dāng)M蛋白與H、F或N蛋白中的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白共表達(dá)時(shí)，可自行組裝成形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子極為相似的病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)，并以出芽方式釋放[26-27].VLPs表面具有高度重復(fù)的氨基酸(AA)結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)B細(xì)胞活化和產(chǎn)生高滴度抗體，具有較強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，免疫動(dòng)物時(shí)不需要添加佐劑.VLPs可通過血清學(xué)檢測區(qū)分自然感染和接種疫苗的動(dòng)物，并且VLPs不含感染性基因組[28-29]，不存在毒力返強(qiáng)的可能，是安全的候選疫苗.桿狀病毒表達(dá)系能高效表達(dá)多種外源蛋白，通常只感染昆蟲，對(duì)人畜不構(gòu)成危害，因此,桿狀病毒廣泛應(yīng)用于病毒樣顆粒等疫苗的研制.

Liu等將PPRV開放閱讀框(ORF)密碼子優(yōu)化的H和M以及天然N基因插入桿狀病毒中構(gòu)建重組桿狀病毒，通過免疫共沉淀、Western blot等方法檢測到M、H和N蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)，成功構(gòu)建昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)，并通過透射電鏡在細(xì)胞膜上觀察到VLPs[30].產(chǎn)生的PPRV-VLPs經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后免疫小鼠和山羊，可激發(fā)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，保護(hù)小鼠和山羊免受PPRV的攻擊[31].Li等人在昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)中共表達(dá)PPRV M和H蛋白或 F蛋白，生成含M和F或M和H蛋白的兩種PPRV VLPs，免疫小鼠和山羊可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體，并促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖.在不使用佐劑的情況下，含有H基因的 VLPs引起的免疫應(yīng)答與使用PPRV疫苗引起的免疫應(yīng)答效果幾乎沒有差異[32].Yan利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)共表達(dá)PPRV M、H、F和N蛋白，獲得含有4種與保護(hù)性免疫有關(guān)蛋白的PPRV- VLPs.將這種VLPs免疫小鼠和山羊后誘導(dǎo)特異性抗體和針對(duì)PPRV的中和抗體表達(dá)，產(chǎn)生保護(hù)性免疫[33].隨后，他們又將來自IV系Tibet/30株和II系Nigeria75/1株的這4種基因分別插入桿狀病毒，構(gòu)建兩種重組桿狀病毒，在High Five高表達(dá)細(xì)胞系中共表達(dá)，產(chǎn)生了兩種PPRV -VLPs，免疫小鼠、山羊和綿羊發(fā)現(xiàn)兩種VLPs均能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答[34].VLPs疫苗具備生產(chǎn)新型疫苗的全部條件，但是VLPs卻不能在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，保護(hù)周期也短.另外,VLPs制備組裝工藝復(fù)雜，較大程度地限制了該類疫苗的發(fā)展．

2.3 聯(lián)合疫苗

聯(lián)合疫苗可誘導(dǎo)中和反應(yīng)對(duì)抗多種小反芻動(dòng)物疫病，而PPRV易與其他病毒發(fā)生并發(fā)感染，如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)[7]、藍(lán)舌病病毒(Luetongue virus，BTV)[35]和山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)[36]等，因此聯(lián)合疫苗的研發(fā)就顯得很有必要.Hosamani等用PPRV弱毒株和GTPV研發(fā)的聯(lián)合疫苗，免疫山羊后可在山羊體內(nèi)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，且在各組分疫苗間不存在免疫原性干擾[37].Wang等發(fā)現(xiàn)，Ad-H和Ad-F聯(lián)合免疫能對(duì)山羊產(chǎn)生很好的保護(hù)作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)于單獨(dú)使用Ad-H或Ad-F免疫[22-38].

反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)具有開發(fā)聯(lián)合疫苗的巨大潛力.該系統(tǒng)利用反向遺傳學(xué)等技術(shù)拯救出感染性基因定點(diǎn)突變的RNA減毒病毒株，獲得反向遺傳學(xué)致弱的活疫苗株.2012年，Hu等利用“分段克隆”的方法克隆出PPRV基因組全長 cDNA，首次建立了PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)拯救出綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的重組PPRV，并且GFP可在10代以內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)[39].Yin隨之利用PPRV操作系統(tǒng)，以PPRV為載體構(gòu)建表達(dá)外源FMDVVP1的重組病毒.該重組病毒株在山羊體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生PPRV和FMDV的中和抗體，抵抗FMDV和PPRV的攻擊，為新型PPRV和FMDV雙重活疫苗的研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[40].Liu構(gòu)建反向遺傳系統(tǒng)并在體外拯救表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲EG95抗原的重組PPRV.雖然重組PPRV復(fù)制緩慢，但能有效地表達(dá)細(xì)粒棘球絳蟲EG95抗原[41]，值得進(jìn)一步研究.

利用反向遺傳操作系統(tǒng)制備的聯(lián)合疫苗毒力返強(qiáng)可能性小，安全性更高，且兼具減毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)，但不足之處是該疫苗不具備DIVA性能.雖然耐熱的新型疫苗是控制和根除該病的關(guān)鍵，但聯(lián)合疫苗可大大降低疫苗接種成本，在小反芻動(dòng)物多種疫病流行區(qū)具顯著優(yōu)勢(shì).利用反向遺傳操作系統(tǒng)還可針對(duì)基因突變的PPRV制備相應(yīng)的PPRV反向遺傳致弱活疫苗，是解決PPRV遺傳進(jìn)化比較有效的措施.

2.4 滅活疫苗

Chen等用含有表達(dá)H或F蛋白的重組羊痘病毒疫苗免疫山羊，發(fā)現(xiàn)該疫苗可刺激產(chǎn)生高水平保護(hù)性免疫，但在已有抗羊痘病毒抗體存在的情況下，該疫苗對(duì)PPRV的抗體反應(yīng)水平會(huì)降低，不能抵抗PPRV強(qiáng)毒的攻擊，甚至出現(xiàn)臨床癥狀[42].滅活疫苗通常不受已有抗體的影響，因此開發(fā)滅活疫苗具有一定的優(yōu)勢(shì).Cosseddu等開發(fā)了一種針對(duì)PPRV的滅活疫苗，該疫苗免疫山羊36天后鼻腔感染強(qiáng)毒PPRV.臨床顯示該疫苗對(duì)PPRV的感染和復(fù)制有阻斷作用[43].在PPRV非流行地區(qū)，結(jié)合佐劑菊粉和TLR9寡核苷酸激活劑的PPRV滅活疫苗具有很強(qiáng)的吸引力，是減毒活疫苗很好的替代品[44].但滅活疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度易受時(shí)間影響，需定期接種加強(qiáng)其免疫效果，不利于大規(guī)模使用.

3 總結(jié)與展望

小反芻獸疫嚴(yán)重威脅著我國的動(dòng)物衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)的發(fā)展，需要采取嚴(yán)厲的強(qiáng)制預(yù)防控制措施.目前控制該病最理想的方法是接種疫苗，因此研制安全、有效、熱穩(wěn)定性高的DIVA疫苗是現(xiàn)今研究工作的首要任務(wù).安全可靠、可復(fù)制的動(dòng)物模型不僅可以進(jìn)行PPR臨床癥狀和發(fā)病機(jī)制的研究，還可以建立評(píng)估疫苗活性和效價(jià)的動(dòng)物模型，對(duì)PPR疫苗的開發(fā)具有重要意義，對(duì)聯(lián)合疫苗有效性的評(píng)估也極為重要.因?yàn)橹苽渎?lián)合疫苗時(shí)，需進(jìn)行大量動(dòng)物試驗(yàn)證明各個(gè)免疫成分之間互不干擾，方可進(jìn)行本體試驗(yàn).Ronchi等認(rèn)為大鼠模型是預(yù)測山羊接種疫苗反應(yīng)的有用模型[44].最近Enchery等建立了山羊攻毒模型，并利用該模型成功評(píng)估了減毒疫苗的活性[45].成功建立可靠的動(dòng)物模型，會(huì)使我們離根除PPR目標(biāo)更近一步.總之，要實(shí)現(xiàn)2030年全面消除PPR的最終目標(biāo)，在PPR疫苗尚不成熟的今天，應(yīng)積極加強(qiáng)對(duì)抵抗和防御外來病的宣傳和教育，同時(shí)建立PPRV的動(dòng)物模型，以便于PPRV病原學(xué)的深入研究，明晰其分子致病機(jī)制和臨床癥狀，建立高效、快速的病原檢測新方法，開發(fā)出高效耐熱的DIVA疫苗.