吳 娜 李永霞

1. mNGS概況

1.1 mNGS發(fā)展史 宏基因二代測序(metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS)也叫作高通量測序。宏基因組是指生物環(huán)境中全部微小生物遺傳物質的總和，它包含了可培養(yǎng)和未可培養(yǎng)的微生物基因(包括細菌、病毒、真菌及其他病原體)。二代測序是相較于一代測序(Sanger測序)而言的，20世紀70年代Sanger利用雙脫氧鏈終止法測序技術首次測定了噬菌體X174的基因組序列，全長5375個堿基，后來將這種方法稱為Sanger法，這標志著人類基因時代開始[1]。一代測序準確性高，設備運行時間短，但是每次反應只能得到一條序列，測序通量較低，耗費成本高，不能滿足人類對龐大基因庫的測序需求。2001年在Sanger法的基礎上加以改進完成了第一個人體全基因組測序。隨著基因技術的發(fā)展，宏基因二代測序應運而生，即mNGS。mNGS是利用通量較高的二代測序技術對送檢樣本宏基因組獨立或并行進行測序。它能夠測序出臨床樣本中幾乎所有人類已知的病原微生物基因，因此測序深度大，覆蓋面廣，且2000年后mNGS成本下降了近5萬倍，目前一次測序3000余人民幣便可完成，并且測序數據量增加1000倍左右[2]，運行效率高，這推動了其在醫(yī)學領域的廣泛利用。

1.2 mNGS用于病原學診斷 2008年和2011年，Palacios等[3]與Xu等[4]分別采用宏基因組及宏轉錄組發(fā)現了兩個臨床感染病例的新發(fā)病原體，分別為沙粒病毒和新型布尼亞病毒，開啟了宏基因組學測序(mNGS)技術在感染中應用的先例。首次用于感染病原體診斷是在2014年，一個患有先天性聯合免疫缺陷綜合征的14歲小男孩在波多黎各旅游回國后反復高熱，醫(yī)生考率為自身免疫性腦炎，便使用糖皮質激素治療，后男孩的病情惡化，出現了嚴重的腦積水和無法控制的癲癇發(fā)作，并一度陷入昏迷。住院期間(6周內)還應用了38項感染病原體檢測，先后更換了5種抗菌藥物[5]，小男孩病情均無改善。C.Y.Chiu教授對小男孩的腦脊液做mNGS檢測，測序結果表明，大多數序列屬于人類，有400多個序列指向鉤端螺旋體，便采用大劑量青霉素治療，小男孩得以成功診治[6]。Wilson[7]將此病例發(fā)表，mNGS成為感染病原體診斷方面的研究熱點，后來相繼將本方法應用于肺部感染[8]、感染性心內膜炎[9]、感染性胰腺壞死[10]、關節(jié)感染[11]等。肺因氣體交換直接與外界相通，這種生理學特性決定了肺部感染高發(fā)病率。既往認為肺部穩(wěn)態(tài)需要無菌，而健康肺部是有菌的，且菌群隨著黏膜擺動和氣流而移動[12]。肺部菌群的多樣性和多變性也導致肺部感染傳統(tǒng)培養(yǎng)方法病原體診斷陽性率低，且上呼吸道感染常常是病毒，病毒變異較快且只能檢測已知病毒，mNGS發(fā)揮了重要作用[13]。因此，mNGS可以提高肺部感染病原體檢出率，特別是對病毒、真菌及特殊病原體更有優(yōu)勢[14，15]。

2. mNGS結果判讀標準

目前對于mNGS結果的判讀仍缺乏統(tǒng)一標準，閱讀Fang X、Chen X、Li Y等人以及現已發(fā)表的大量文獻[16～21]，將mNGS結果判讀總結如下：(1)測序覆蓋率排名前10的病原體中，序列數>3。(2)病原體的相對豐度在屬水平>30%。(3)傳統(tǒng)檢測方法與mNGS檢測出共同的病原體，且來自該病原體的獨特序列片段>50；若序列數<50,但符合臨床診療也可診斷。(4)細菌、病毒、寄生蟲(分枝桿菌、諾卡氏菌除外)檢出序列數是相同類型微生物的10倍。(5)病毒比對序列數>100。(6)mNGS檢測到的真菌序列數是其余所有真菌的5倍以上。(7)結核分枝桿菌、諾卡菌、嗜肺軍團菌序列數≥1。(8)若僅mNGS檢測陽性，則該病原體被認為是疑似病原體，需滿足以下兩點：①文獻證實該病原體有肺部致病性；②每百萬閱讀序列比正常人陰性對照高出2倍。(9)mNGS陰性結果在排外感染性疾病方面具有較高的價值。

總而言之，mNGS結果應以測序深度、序列數量、覆蓋度、置信度、相對豐度數值作為參考，臨床醫(yī)生結合患者臨床流行病學、病史、體征、實驗室檢查炎性指標、胸部CT影像學等方面綜合判斷[21]。

3. mNGS檢測肺部感染的標本選擇

mNGS的原理是對臨床樣本中來自人體和微生物的所有核酸序列進行檢測，微生物核酸序列占總核酸序列不足5%，且不同臨床樣本人源性核酸含量不同，單位體積人核酸含量排序為：胸腹水>痰液>血漿>支氣管肺泡灌洗液>腦脊液，人源性核酸含量越多，對結果的靈敏度及特異度干擾越大，堿基序列片段的檢測敏感度閾值越大[22]。不同類型感染時病原體分布不同，因此每一種臨床樣本在mNGS檢測病原體中各有優(yōu)勢。

3.1 血液 血液標本采集方便，臨床中比較容易獲得。肺組織血供豐富，肺部感染時病原體及其分解片段可進入血液，從而能夠被檢測到，當發(fā)生菌血癥或膿毒血癥時，血液檢測為最佳標本。血液可避免口腔定植菌的干擾，采集過程中受污染的可能性也較小。盡管血液靈敏度不如肺泡灌洗液，當患者不能耐受支氣管鏡而無法獲得支氣管肺泡灌洗液時，血液可作為檢測標本。而且重癥肺炎常常并發(fā)血流感染，Chen J[23]等人將20例重癥肺炎患者的血液和BALF同時行mNGS檢測發(fā)現，有10例患者血液和BALF均為陽性，且血液與BALF中的病原體高度一致，這一結果表明重癥肺炎50%可能合并血流感染，此時血液與BALF具有同樣的敏感性。

3.2 痰液 肺部感染患者痰培養(yǎng)是一項常規(guī)檢查，痰液里病原體較多，容易被檢出。痰液采集過程及采集方式對結果準確性影響較大，經口咳出痰液最容易獲得，對患者無創(chuàng)傷，但痰液經上呼吸道、口腔咳出會帶入口腔定植菌，而對于深部肺組織感染代表性較差，從而干擾結果的判讀；經吸痰管吸取深部痰，可避免口腔定植菌干擾，但只有氣管插管建立人工氣道的危重患者才能獲得，且吸痰管會損傷患者氣道黏膜，加重缺氧或誘發(fā)肺不張等。痰液里人源性核酸含量多于血液和BALF，因此若選擇痰液送檢，結果分析時應綜合考慮排除定植菌和污染。然而，痰液檢測非結核分枝桿菌優(yōu)于其他方法，繆青[24]等人研究中，83例痰標本傳統(tǒng)培養(yǎng)檢出47例，mNGS檢出19例，mNGS方法檢出例數肺泡灌洗液(33)>肺組織(25)>痰液(19)，由此可得出在非結核分枝桿菌檢測中痰培養(yǎng)具有顯著優(yōu)勢，當臨床懷疑結核或肺結核分枝桿菌感染，可將選擇痰液作為標本送檢。

3.3 經氣管鏡獲得標本—肺泡灌洗液(BALF)、經支氣管鏡肺活檢組織(TBLB)、支氣管針刷標本(BB) 經氣管鏡可獲得BALF、TBLB、BB等標本，這些標本均可大大避免口腔及上呼吸道定植菌的干擾，且防污染支氣管肺泡灌洗也減少了污染的機會，因此這些標本均可提高檢測結果的準確性。由于支氣管鏡為侵入性檢查，需評估患者的氧飽和度及肺部情況，若不能耐受支氣管鏡時應選擇其他標本進行檢測。Wang Q[25]等的一項研究比較了通過mNGS診斷周圍肺部感染在經支氣管肺活檢組織(TBLB)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、支氣管針刷標本(BB)、以及TBLB+BALF+BB聯合等四種不同標本的診斷效能，結果發(fā)現在診斷細菌感染方面，TBLB、BALF、BB以及TBLB+BALF+BB四者敏感性無明顯差異；而在診斷真菌感染及未分類病原體感染方面，敏感性TBLB+BALF+BB>BB>BALF>TBLB；TBLB特異性最高，其次是BB、BALF。因此當臨床懷疑真菌及不明原因的病原體感染時，可通過支氣管鏡獲取TBLB、BALF、BB進行聯合檢測，提高病原體檢出率。

目前研究中mNGS檢測肺部感染絕大多數采用肺泡灌洗液，肺泡灌洗液人源性核酸含量最低，對結果干擾最小，而且樣本來自深部肺組織，對深部肺部感染有較好的代表性。大量研究也證實肺泡灌洗液檢測效率優(yōu)于血液和痰液。Chen X[18]等人的研究采用配對設計比較了血液和肺部灌洗液在肺部感染中的診斷效能，結果顯示肺泡灌洗液檢測靈敏度高于血液(81.3%>25.0%，P=0.003)；而特異度血液略高于肺泡灌洗液(84.6%>76.9%，P=0.317),但差異無統(tǒng)計學意義。綜上所述，BALF是肺部感染mNGS檢測的最佳標本。

4.局限性與展望

mNGS在病原體檢測方面具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，尤其對于混合感染具有絕對優(yōu)勢，但仍然存在一些需改進的問題。第一，mNGS技術本身缺乏行業(yè)標準和規(guī)范，部分商家受利益驅動縮小測試數據量至1M～5M，從而可能出現結果的假陰性。第二，mNGS技術在文庫制備及病原體識別方面缺乏統(tǒng)一、全面、準確的參照數據庫，導致不同檢測機構的結果可能會有差別，也沒有統(tǒng)一的診斷標準。第三，mNGS結果判讀缺乏學術界公認的指南或專家共識，臨床醫(yī)生對于結果判讀依靠臨床經驗，有望隨著研究的進一步深入，形成統(tǒng)一的標準。第四，標本中人源性背景核酸干擾mNGS結果,去人源化技術有待進一步提高。本文通過對現有的研究進行總結歸納，為臨床醫(yī)生進行mNGS結果判讀及標本選擇提供參考意見。