呂 興 楊書(shū)紅

1.武漢市泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院普外科，湖北武漢 430050；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430030

肝臟的發(fā)育受到時(shí)間與空間的精細(xì)調(diào)控。肝臟發(fā)育不同階段的差異表達(dá)基因（DEGs）對(duì)其結(jié)構(gòu)形成、功能的成熟有關(guān)鍵作用。小鼠在孕8.5～9.5 d（人類(lèi)孕23～26 d）可檢測(cè)到肝細(xì)胞特異性遺傳標(biāo)記[1]，從13.5 d 左右（人則從孕56～58 d 開(kāi)始，孕210 d 左右結(jié)束）來(lái)源于內(nèi)胚層組織的肝祖細(xì)胞開(kāi)始向肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞分化，隨后在特定基因的調(diào)控下逐漸發(fā)育成熟，功能亦逐漸完善[2]。在此期間mRNA 表達(dá)譜亦隨著時(shí)間逐漸發(fā)生變化[3]。為深度分析肝臟在胚胎期與成熟期表達(dá)基因差異性，本文將對(duì)胚胎期（ED14）與成熟期（PND 56）表達(dá)譜芯片進(jìn)行分析，深度挖掘肝臟發(fā)育過(guò)程中的變化機(jī)制。

1 方法學(xué)

1.1 DEGs 的篩選

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載編號(hào)為GSE65063 的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，提取其中ED14 及生后56 d（PND 56）芯片，采用在線分析軟件GEO2R 完成DEGs 篩選，表達(dá)差異用差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P ＜0.001，|log2FC|≥2。將原始數(shù)據(jù)下載，匹配出篩選的上調(diào)及下調(diào)前25 個(gè)基因相對(duì)應(yīng)的矩陣表達(dá)值，利用軟件HemI 進(jìn)行熱點(diǎn)圖繪制。采用Excel 繪制火山圖。

1.2 DEGs 的富集分析

使用DAVID 在線分析網(wǎng)站分別對(duì)上調(diào)和下調(diào)DEGs 進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）生物學(xué)通路富集分析。

1.3 DEGs 編碼蛋白質(zhì)的相互作用（PPI）分析

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs 所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，探尋PPI 規(guī)律（結(jié)合可信度選擇0.7），運(yùn)用CytoScape 軟件完成可視化；隨后進(jìn)行功能模塊構(gòu)建（采用CytoScape 軟件中加載的MCODE 插件），將排列前3 的模塊分別導(dǎo)出，并將該3 個(gè)模塊相關(guān)基因?qū)朐诰€分析軟件STRING 進(jìn)行GO 與KEGG 分析。

1.4 篩選樞紐基因

采用Cytoscape 軟件中加載的CytoHubba 插件中的12 種拓?fù)浞治龇椒ㄓ?jì)算PPI 網(wǎng)絡(luò)中各蛋白質(zhì)的拓?fù)鋮?shù)，將12 種算法所獲參數(shù)從大到小進(jìn)行排序，取前20 個(gè)基因，12 種算法中，初步認(rèn)為有5 種及以上算法都排在前20 的基因?yàn)闃屑~基因。

1.5 探討關(guān)鍵樞紐基因的相互作用關(guān)系

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建關(guān)鍵樞紐基因之間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 DEGs 篩選結(jié)果

成熟期肝臟與胚胎期比較，共篩選出2969 個(gè)DEGs，其中上調(diào)1620 個(gè)，下調(diào)1349 個(gè)。如圖1A箱線圖所示，六組樣本均值基本在一條直線，可用作后續(xù)分析。DEGs 火山圖與前50 個(gè)DEGs 的熱點(diǎn)圖如圖1B、C所示。

圖1 GSE65063 芯片分析結(jié)果

2.2 DEGs GO 與KEGG 富集分析結(jié)果

GO 分析分為3 個(gè)部分：細(xì)胞組分、分子功能及生物過(guò)程。

2.2.1 上調(diào)DEGs 分析結(jié)果 如圖2 所示，上調(diào)DEGs明顯富集的細(xì)胞成分主要在細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞器膜、線粒體等。富集的分子功能包括氧化還原酶活性、鐵離子結(jié)合、單氧酶活性、芳香化酶活性等。生物過(guò)程主要富集在代謝相關(guān)過(guò)程包括氧化還原、脂代謝、脂肪酸代謝、三酰甘油及穩(wěn)態(tài)維持等方面。上調(diào)DEGs 主要富集在代謝有關(guān)通路如代謝通路、化學(xué)致癌、視黃醇代謝、甾體激素合成等。

2.2.2 下調(diào)DEGs 分析結(jié)果 下調(diào)DEGs 明顯富集的細(xì)胞成分則主要分布在細(xì)胞核、細(xì)胞漿、染色體、核質(zhì)等與細(xì)胞增殖分裂相關(guān)的細(xì)胞器。分子功能富集的條目包括DNA 結(jié)合、核酸結(jié)合、蛋白結(jié)合、多聚（A）RNA 結(jié)合等。生物過(guò)程包括：細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、DNA 復(fù)制、DNA 修復(fù)等。這些條目與細(xì)胞增殖分裂密切相關(guān)。

下調(diào)DEGs 富集的KEGG 信號(hào)通路（FDR＜0.05）與細(xì)胞增殖、分裂有關(guān)，如細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)等共7 條。見(jiàn)圖3。

2.3 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)功能模塊分析結(jié)果

圖2 上調(diào)DEGs GO 與KEGG 信號(hào)通路富集分析（展示前15 個(gè)條目）

圖3 下調(diào)DEGs GO 與KEGG 信號(hào)通路富集分析（展示前15 個(gè)條目）

模塊一（圖4A，見(jiàn)封三）全部為下調(diào)基因主要富集于與細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老相關(guān)的信號(hào)通路。功能上亦富集于與細(xì)胞周期、分裂相關(guān)的細(xì)胞組分、生物過(guò)程及細(xì)胞器。模塊二（圖4B，見(jiàn)封三）主要與補(bǔ)體系統(tǒng)、膽固醇代謝及PARP 信號(hào)通路有關(guān)。模塊三（圖4C，見(jiàn)封三）主要與視黃醇代謝、甾體激素合成等代謝有關(guān)。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中前3 位顯著富集的基因模塊

2.4 樞紐基因篩選結(jié)果

共篩選出16 個(gè)樞紐基因，其中14 個(gè)表達(dá)下調(diào)，包 括：Cdk1、Ccnb1、Cdc20、Plk1、Aurkb、Aurka、Birc5、Cdca8、Ube2i、Hsp90aa1、Mad2l1、Bub1b、Bub1 與Ndc80。2 個(gè)上調(diào)基因分別為Egfr 與Apob。

如圖5A 所示，所有下調(diào)基因之間構(gòu)成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。上調(diào)基因Egfr 與5 個(gè)下調(diào)基因（Ccnb1、Cdk1、Aurka、Hsp90aa1、Birc5）之間構(gòu)成復(fù)雜調(diào)控關(guān)系。GO 與KEGG 分析（圖5B）結(jié)果提示這些樞紐基因主要與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、細(xì)胞周期等相關(guān)。功能上則與信號(hào)通路相呼應(yīng)。

3 討論

圖5 樞紐基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖與功能分析

肝臟發(fā)育具有時(shí)間與空間特異性，本研究將胚胎期與成熟期肝臟表達(dá)譜芯片結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)階段肝臟表達(dá)基因具有顯著差異，且上調(diào)差異基因群明顯表現(xiàn)為肝臟功能相關(guān)基因，而下調(diào)基因群則與細(xì)胞增值分裂顯著相關(guān)。這與Jochheim 等[3]的芯片結(jié)果一致，該研究比較了胚胎不同時(shí)期（E7.5、E11.5、E13.5）與成年期（2～7 月）小鼠肝臟基因表達(dá)差異，與本研究一致，成年期小鼠肝臟DGEs 主要與肝臟代謝功能成熟相關(guān)。這提示肝臟的生長(zhǎng)發(fā)育及功能成熟受到不同基因群的精細(xì)調(diào)控，并且這種調(diào)控具有時(shí)間與空間特性。

在本研究中，上調(diào)與下調(diào)差異基因有明顯的變化，功能變化尤其顯著，體現(xiàn)了肝臟從發(fā)育階段轉(zhuǎn)換成功能發(fā)揮階段。如上調(diào)基因在細(xì)胞中富集的細(xì)胞器成分包括細(xì)胞器膜、線粒體、過(guò)氧化物酶體等均為代謝密集發(fā)生地，這些場(chǎng)所分布著調(diào)控肝代謝的關(guān)鍵基因，維持著機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)。若這些細(xì)胞器發(fā)生異常，則可出現(xiàn)代謝紊亂包括血脂異常、高膽固醇血癥等[4]。而了解正?；虮磉_(dá)水平的變化是發(fā)現(xiàn)異?；虮磉_(dá)及其功能異常的基礎(chǔ)。因此，這些差異基因是機(jī)體功能維持正常的根本，若基因發(fā)生異常如富集于過(guò)氧化物酶體相關(guān)基因ACOX2、ACOX1 缺陷則可出現(xiàn)脂肪酸代謝異常[5]。研究發(fā)現(xiàn)在上調(diào)基因中，上調(diào)倍數(shù)排在前三的主要尿蛋白：Mup6（10.7 倍）、Mup5（9.5 倍）、Mup1（9.4 倍）為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的成員。目前研究認(rèn)為其主要表達(dá)于肝臟[6]，在其他器官亦有表達(dá)，作為信息素及載體，可維持嗅神經(jīng)電位穩(wěn)定[7]，與多種活動(dòng)有關(guān)[8]，但是這些基因表達(dá)缺失或者異常是否與肝臟代謝異常尚無(wú)相關(guān)研究，值得進(jìn)一步探討。

而下調(diào)基因群則主要為細(xì)胞增殖分裂相關(guān)基因。胚胎期肝臟處于快速發(fā)育期，一旦發(fā)育成熟，相關(guān)基因表達(dá)將下調(diào)，以達(dá)到維持肝臟功能轉(zhuǎn)換的目的。這些基因的表達(dá)水平維持在一個(gè)平衡狀態(tài)。如平衡被打破，下調(diào)基因表達(dá)上調(diào)，則提示肝臟可能出現(xiàn)異常增生。如下調(diào)倍數(shù)最多的基因Hemgn（Hemogen）（7.2 倍），與小鼠肝臟血竇發(fā)育密切相關(guān)，在人類(lèi)對(duì)應(yīng)的同源基因（embryonic develop-associated gene 1，EDAG-1）則可能與血液系統(tǒng)腫瘤、甲狀腺癌有關(guān)[9-10]，腫瘤患者放療后亦出現(xiàn)該基因表達(dá)上調(diào)[11]，但是否與肝臟腫瘤相關(guān)，尚無(wú)相關(guān)研究。值得注意的是，在下調(diào)基因富集的信號(hào)通路中，兩條與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、成熟相關(guān)的通路亦下調(diào)，提示機(jī)體不同器官之間可能存在類(lèi)似的調(diào)控機(jī)制，從而達(dá)到能量節(jié)省的目的，使機(jī)體更加協(xié)調(diào)一致。

PPI 網(wǎng)絡(luò)通常在檢查蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)以及識(shí)別新的蛋白質(zhì)功能方面發(fā)揮重要作用[12-14]。在本研究中，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)排在首位的模塊（MCODE 評(píng)分54.329）包含的基因均為下調(diào)基因，通過(guò)GO 及KEGG 分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集于與細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老相關(guān)類(lèi)別。這提示肝臟成熟后，與細(xì)胞增殖相關(guān)基因被嚴(yán)格調(diào)控，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)資源進(jìn)行合理分配，更多資源分配于合成肝臟代謝相關(guān)蛋白，體現(xiàn)在排在第二（MCODE 評(píng)分31）及第三位（MCODE 評(píng)分23）模塊主要向代謝相關(guān)基因富集。這進(jìn)一步提示在肝臟功能轉(zhuǎn)換過(guò)程中，基因表達(dá)模塊亦出現(xiàn)相應(yīng)調(diào)整，更加有利于功能的發(fā)揮。

在樞紐基因中，14 個(gè)下調(diào)基因主要與細(xì)胞周期相關(guān)。正常情況這些樞紐基因處于“沉睡狀態(tài)”，而在異常情況下“沉睡狀態(tài)”可能被喚醒。當(dāng)處于胚胎期時(shí)，肝臟處于形成狀態(tài)，因此表達(dá)豐度較高，肝臟成熟后，則其表達(dá)需相應(yīng)下調(diào)。成熟期肝臟如出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，則提示肝臟可能出現(xiàn)異常。如肝部分切除后肝臟出現(xiàn)再生時(shí)，下述基因如Cdk1、Plk1、Cdc20、Aurka 上調(diào)，這與本研究結(jié)果相符合，當(dāng)肝臟被切除部分后，再生機(jī)制被激活，因此細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)[15]。而當(dāng)肝臟出現(xiàn)異常增生時(shí)，即肝臟出現(xiàn)腫瘤時(shí)，亦可能出現(xiàn)上述樞紐基因表達(dá)的上調(diào)。Yang 等[16]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中過(guò)表達(dá)樞紐基因如CDK1、CDC20、BUB1、BUB1B、MAD2L1 等預(yù)示肝細(xì)胞癌患者預(yù)后較差。此外，數(shù)個(gè)生信分析結(jié)果得出相似結(jié)果[17-19]。Hsp90aa1 作為其中樞紐基因之一，亦被證實(shí)與周?chē)８谓M織比較，癌組織表達(dá)豐度更高[20]。另有研究認(rèn)為其可作為肝臟預(yù)后及監(jiān)測(cè)指標(biāo)[21]。Bracht 等[22]研究發(fā)現(xiàn)Birc5 基因缺陷的小鼠，肝臟再生受損，而Chaudhary 等[23]的研究則提示Birc5 可作為肝癌指標(biāo)。上述研究結(jié)果表明相關(guān)樞紐基因可能與早期肝癌的診斷及預(yù)后密切相關(guān)。預(yù)示著這些樞紐基因可作為肝癌患者早期診斷及判斷預(yù)后的指標(biāo)。

上調(diào)樞紐基因?yàn)镋gfr 與Apob。Egfr 與肝臟功能的發(fā)揮緊密相連，該受體參與肝臟的各項(xiàng)功能，肝臟疾病的發(fā)生亦與此基因相關(guān)[24]。Apob 則因與肝臟脂代謝密切相關(guān)，如出現(xiàn)異常，可出現(xiàn)高膽固醇血癥等代謝疾病[25]。

綜上，肝臟成熟期與胚胎期基因表達(dá)譜有顯著差異，肝臟的發(fā)育及成熟在不同時(shí)間與空間受到特定基因群調(diào)控，在成熟期肝臟，以代謝相關(guān)基因?yàn)橹?，在胚胎期則主要富集于細(xì)胞增殖分裂相關(guān)基因。篩選出來(lái)的樞紐基因尤其是下調(diào)基因可能作為肝臟異常如肝癌等疾病的早期診斷與判斷預(yù)后的指標(biāo)，具有重要臨床意義。