劉寶山 張輝 徐又佳

蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科、骨質疏松臨床中心 蘇州大學骨質疏松癥診療技術研究所，江蘇 蘇州215004

骨質疏松癥(osteoporosis)是一種增齡性骨代謝疾病，其特征是骨密度降低，骨骼脆性和骨折風險增加[1-3]。骨質疏松癥主要在50歲以后女性和65歲以后男性中多見[2]；但是，也有研究認為骨質疏松癥與多種危險因素和遺傳因素密切相關，不過目前仍缺乏有效的預測和預防方法[4]。蛋白質是細胞功能的效應者，與疾病表型的關系比基因或轉錄更密切；蛋白組學是以蛋白質組為研究對象，研究細胞、組織或生物個體蛋白質組成及其變化的規(guī)律。因此，蛋白組學對于識別疾病新的診斷和治療靶點或監(jiān)測疾病的進展具有重要作用[5]。

1 生物學標志物和蛋白組學

生物學標志物是生物體受到嚴重損害之前，在系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞水平發(fā)生改變的信號指示物。它可以是細胞分子結構和功能變化，也可以是某一生化代謝過程變化。通過對生物學標志物的測定可了解機體當下所處的生物學過程，對疾病預防、早期診斷和治療具有積極意義[6]。

蛋白質組學正被眾多學科應用，它可以檢測正常或疾病狀態(tài)下組織全部表達蛋白質在量上的差別。早期最常用的是雙向電泳技術，后來發(fā)展出的非凝膠蛋白質組學技術包括了質譜分析(mass spectrometry，MS)、高效液相色譜分析(high performance liquid chromatography, HPLC)、液質聯(lián)用以及蛋白芯片等[7]。與基因組學和轉錄組學相比，蛋白組學在識別病理條件下細胞內失調的蛋白和通路更高效，有助于發(fā)現(xiàn)疾病特異性突變和表觀遺傳學改變[8]，這也使得蛋白組學成為獲取生物學標志物的重要技術手段。2020年權威期刊《NATURE REVIEWS GENETICS》發(fā)表綜述，認為對人體細胞、組織和體液的“蛋白質組學分析”可為探究人類復雜生物學過程提供有價值的參考，非常有助于理解遺傳和非遺傳因素如何影響著疾病的結局，從而揭示與疾病相關的生物學途徑和生物學標志物，獲得疾病新的藥物靶點[7]。

2 骨質疏松癥領域人體蛋白組學研究

為了深入研究骨密度的分子決定因素，許多學者開展了蛋白組學研究，對骨相關細胞或組織中表達的蛋白質進行分類篩選，以確定與骨質疏松癥發(fā)病相關的蛋白質，從而獲得診斷骨質疏松癥或預測骨質疏松骨折的生物學標志物。

2.1 單核細胞蛋白組學

主要是指從外周血中分離出單核細胞進行蛋白組學分析以鑒定骨質疏松癥相關的生物學標志物。由于在骨密度峰值期(即絕經前，20～45歲)，女性骨代謝處于骨形成和骨吸收的相對平衡狀態(tài)，為探索不同個體之間骨密度差異的內在遺傳因素提供了一個獨特的“窗口期”。因此，2008年Deng等[9]從1 000名中國絕經前女性中篩選出30名具有極高和極低髖部骨密度的受試者，采集分離外周血單核細胞，通過蛋白組學方法獲得38個差異表達蛋白。其中，超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)在骨質疏松癥患者體內分別顯著上調和下調；由于SOD2可催化超氧化物生成過氧化氫(H2O2)，而GPX1可保護H2O2引起的氧化應激損傷，是人體最重要的抗氧化酶之一，作者提出SOD2和GPX1可能共同作用于細胞，調節(jié)H2O2水平。之前有研究表明，H2O2可以刺激破骨細胞分化，并增強成熟破骨細胞活性[10]。此外，在RAW 264.7細胞系中過表達GPX可抑制其向破骨細胞分化和形成[11]。因此，Deng等在低骨密度組中檢測到的SOD2上調和GPX1下調可能促進破骨細胞的分化、形成和活性，在骨質疏松癥發(fā)病機制中起重要作用。

Deng等[12-13]針對絕經前白人婦女的研究結果顯示膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)和凝溶膠蛋白(GSN)在低骨密度受試者的外周單核細胞中分別顯著上調和下調。體外實驗表明，ANXA2可顯著促進單核細胞跨內皮屏障的遷移，在低骨密度受試者中ANXA2表達水平升高，可能會刺激更多的單核細胞在體內通過血管壁遷移到骨表面，從而促進單核細胞向破骨細胞分化以及骨吸收，導致骨密度降低[13]。另外，Deng等認為GSN可能通過與雄激素受體(AR)相互作用，增強雄激素誘導的AR反式激活，從而抑制單核細胞的生長，并促進單核細胞凋亡，減少破骨細胞的形成和骨吸收，增加骨密度[12,14]。2015年Daswani等[15]研究發(fā)現(xiàn)與RANKL相關的熱休克蛋白27(HSP27)在絕經前和絕經后低骨密度婦女的單核細胞中均明顯上調；與上述ANXA2研究類似，HSP27體外實驗也提示HSP27可促進單核細胞的遷移，從而促進破骨細胞的形成和骨吸收。綜上所述，ANXA2、GSN和HSP27有可能作為骨質疏松癥的潛在生物學標志物。2017年Zeng等[16]建立了第一個人單核細胞蛋白組學庫，共包含2 237個蛋白質編碼基因，也將為單核細胞生物學與骨質疏松癥的深入研究提供了參考。

2.2 血清、血漿蛋白組學

主要是指用蛋白組學的方法直接從血漿或血清中鑒定相關生物學標志物。Ozgocmen等[17]研究提示患有骨質疏松癥的絕經后女性的血漿中SOD酶活性顯著高于非骨質疏松癥組；此外，一些生活質量評分，如疼痛、精神和社會功能與SOD酶活性也相關。因此，SOD可能是絕經后女性發(fā)生骨質疏松癥的重要指標。Zhou等[3]研究發(fā)現(xiàn)中國老年人血漿中ANXA2蛋白水平與髖部骨密度呈負相關。體外實驗表明，ANXA2以濃度依賴方式調節(jié)成骨細胞hFOB1.19生長，其在較低濃度時可促進成骨細胞生長，而在較高濃度時促成骨細胞生長作用減弱，這就解釋了在低骨密度者中觀察到血漿ANXA2水平升高的現(xiàn)象。當然，血漿ANXA2蛋白水平是否能預測骨質疏松癥和骨質疏松骨折還有待于進一步研究。

Bhattacharyya等[18]研究發(fā)現(xiàn)絕經后婦女血清中的間α胰蛋白酶抑制劑重鏈H4(ITIH4)可使破骨細胞活性增加，導致骨密度降低，骨折風險升高。目前，臨床研究中預測骨質疏松性骨折的血清生物學標記物主要是通過橫斷面研究確定，但也有少部分從前瞻性研究中確定。Arasu等[19]發(fā)表了一項前瞻性隊列研究，結果顯示在老年女性中，血清硬化素(sclerostin)水平越高，髖部骨折風險越大?，F(xiàn)在，硬化素抗體Evenity(romosozumab)已被FDA批準上市，用于治療絕經后伴隨有高骨折風險的骨質疏松癥。

2.3 外泌體蛋白組學

主要是指從骨相關細胞及其微環(huán)境各種組分中分離出外泌體以鑒定相關生物學標志物。近年來，外泌體蛋白組學受到越來越多的關注，其中也包括骨相關細胞來源的外泌體[20-21]。2015年Ge等[20]從小鼠來源MC3T3細胞培養(yǎng)上清液中分離出微囊泡，用蛋白質譜的方法鑒定了外泌體含量以及潛在的成骨相關蛋白和通路。結果顯示，外泌體主要來源于細胞質膜，主要參與蛋白質定位和細胞內信號轉導，且真核細胞起始因子2通路在成骨過程中起著重要的作用。2018年Xie等[22]對老年骨質疏松癥或骨量減少患者和正常志愿者血清中純化的外泌體進行了定量蛋白組學分析，共鑒定了1 371種蛋白。后續(xù)生物信息學分析和體外研究表明，骨質疏松癥患者血清來源外泌體中蛋白的變化不僅參與了抑制整合素介導的成骨細胞的機械感受和激活，還觸發(fā)了破骨細胞分化和吸收；相反，骨量減少患者的血清來源的外泌體既促進了破骨細胞激活又促進了新骨形成，這可能導致骨重塑代償性升高；而老年正常志愿者的血清來源的外泌體可能通過抑制衰老相關的氧化應激而對骨健康起到保護作用。2020年還有類似研究發(fā)表，Chen等[23]應用定量蛋白質組學方法比較了骨質疏松癥患者、骨量減少患者和骨量正常者血漿外泌體的蛋白表達，共鑒定了45個差異蛋白；其中4個，PSMB9，AARS，PCBP2和VSIR得到了進一步的驗證。

PSMB9是一種蛋白酶復合體，一些基礎研究已經揭示了蛋白酶體在成骨細胞和破骨細胞活性調節(jié)中的重要作用。Garrett等[24]研究發(fā)現(xiàn)，抑制蛋白酶體的特定催化β亞基可以通過增強成骨細胞的功能和增加成骨細胞的數(shù)量來促進體外和體內的骨形成。Chandra等[25]研究提示一種用于治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑Bortezomib可能在治療放射性骨質疏松癥方面起作用。其余3種蛋白尚未有報道它們與骨質疏松癥有關。PCBP2已被證明與RNA結合蛋白K相互作用，后者主要參與破骨細胞形成，調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[26]。VSIR是一種免疫調節(jié)受體，可抑制BMP4信號，而BMP4參與骨骼和軟骨的發(fā)育，特別是四肢的發(fā)育和骨折的修復[27]。AARS可能導致肌肉無力和萎縮，但沒有證據(jù)表明AARS對骨量有影響[28]。以上結果為進一步研究骨質疏松的病理機制和治療靶點提供了參考。

2.4 骨組織蛋白組學

主要是直接從骨骼組織中鑒定相關的生物學標志物。骨組織樣本往往參雜了造血干細胞、基質干細胞和內皮細胞等多種細胞類型，由此獲得的組學結果反映了一個復合的細胞環(huán)境，其中，骨細胞占95 %以上。因此，骨組織蛋白組學結果仍具有較強的說服力[29]。2011年Alves等[30]從4個行髖關節(jié)置換術的患者獲得健康松質骨片段，然后用質譜的方法進行骨組織蛋白組學分析，產生了一個包含3 038種蛋白的文庫。該文庫不僅含有大多數(shù)經典骨基質蛋白，還包含了一些具有未知功能蛋白，是骨質疏松癥等骨相關疾病生物學標志物的來源。2012年Chaput等[31]用質譜的方法，對比患骨關節(jié)炎伴有骨量減少和患骨關節(jié)炎但骨量正常的患者股骨中蛋白質表達差異。結果表明，在骨量減少情況下，碳酸酐酶I(CA1)和磷酸甘油酸激酶1(PGK1)增加，而載脂蛋白A-1(apoA-1)減少。綜上所述，骨組織蛋白組學能反映在骨質疏松癥與非骨質疏松癥人群骨骼中直接執(zhí)行功能的差異蛋白，為尋找直接干預的藥物靶點提供了全新角度。

3 動物骨質疏松癥領域蛋白組學研究

由于倫理原因，利用組學研究人體骨重塑過程還是受到一定限制。此外，人體研究可能會受到許多混雜因素的影響，如飲食和生活方式，這些因素幾乎不可能被控制，而且在樣本可獲得性方面也可能存在限制，動物模型規(guī)避了上述問題。當然，動物模型不一定能完全模擬人類疾病生物學過程，比如在骨代謝研究時我們需要考慮動物與人體在骨骼新陳代謝和成分上的差異。

目前，骨質疏松癥相關的動物骨組織蛋白組學研究很少。2005年Fan等[32]通過建立去勢雌性大鼠(OVX)模型研究雌激素缺乏對大鼠骨骼蛋白表達的影響，結果鑒定出三種不同的蛋白質與骨質疏松相關，分別為硫氧還蛋白過氧化物酶1(TPX1)、肌球蛋白輕肽2(MYL2)和泛素綴合酶E2-17kD(UBE2D2)。同年，Pastorelli等[33]一項針對小鼠的研究表明，與細胞骨架和能量通路相關的蛋白可能是骨組織中重要的雌激素調節(jié)蛋白，在骨代謝中起到重要作用。2009年Huang等[34]發(fā)現(xiàn)與假手術大鼠相比，OVX大鼠骨組織非膠原蛋白減少。2017年Calciolari等[35-36]首次評估了正常和OVX大鼠在不同階段骨形成過程中的蛋白質表達，結果發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E(ApoE)和載脂蛋白A-IV(Apo A-Ⅳ)在OVX大鼠中都顯著高表達；此外，凝膠電泳和質譜結果顯示骨質疏松大鼠體內炎癥和應激反應增強。

4 小結

蛋白質可通過轉錄剪接、翻譯后修飾等機制產生多種產物，對生物生理和病理功能產生直接影響。因此，鑒定在骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展過程中起主要作用的蛋白質對明確機制和完善治療具有重要意義。蛋白組學主要通過檢測遺傳位點在蛋白質水平的表達變化，來尋找差異表達蛋白質與疾病發(fā)生發(fā)展之間的關聯(lián)，以期更準確地推測骨質疏松癥的發(fā)病機制和治療靶點?，F(xiàn)有證據(jù)表明，蛋白組學為骨質疏松癥機制研究開拓了全新思路，為尋找可靠的早期診斷、療效和預后評價的生物學標志物提供了依據(jù)。但是，目前通過蛋白組學發(fā)現(xiàn)的骨質疏松癥相關生物學標志物尚未被轉化應用于臨床。因此，未來的研究不僅要致力于探索骨質疏松癥特異性生物學標志物，還應對已證實的生物學標志物及可能治療骨質疏松癥的藥物進行進一步探索效驗。從而使蛋白組學技術真正在臨床發(fā)揮作用。此外，骨質疏松癥相關組學研究現(xiàn)在正朝著多組學融合的方向發(fā)展，以期更好地理解復雜生理病理機制，其最終目標是根據(jù)每一位患者的需要量身定制治療方案來改善骨質疏松癥的結局。