金銘，謝露露，毛妮，沈旭波，魏建子，沈雪勇，毛慧娟

0 引言

癌因性疲勞（cancer-related fatigue,CRF）作為較為常見(jiàn)的癌癥治療相關(guān)癥狀之一[1]，是指由于癌癥及其相關(guān)治療導(dǎo)致患者長(zhǎng)期痛苦和緊張而產(chǎn)生的一系列主觀感覺(jué)，常表現(xiàn)為持續(xù)的疲憊感，與近期活動(dòng)不成比例并且干擾了患者的正常功能[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)25%～99%的患者在治療期間經(jīng)歷了CRF[3]，嚴(yán)重影響了患者的正常生活。盡管近些年來(lái)出現(xiàn)越來(lái)越多的新型癌癥治療方法，但化療仍是運(yùn)用廣泛的治療手段，它會(huì)導(dǎo)致CRF的形成并/或加重其程度。目前關(guān)于CRF發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)主要包括細(xì)胞因子失調(diào)、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸調(diào)節(jié)失常、神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)異常、三磷酸腺苷和肌肉代謝改變、貧血以及社會(huì)心理因素等[4]，但關(guān)于CRF的有效治療方法仍未有定論。因此建立CRF的相關(guān)臨床前模型以探究其機(jī)制，并區(qū)分不同干預(yù)效果的差異進(jìn)而發(fā)現(xiàn)特定的治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。本研究通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外CRF動(dòng)物模型相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為今后CRF造模方案提供依據(jù)。

1 動(dòng)物選擇

嚙齒類(lèi)動(dòng)物是臨床較常選擇的化療動(dòng)物模型，其具有體型小、繁殖迅速、操作簡(jiǎn)單及品系種類(lèi)多等優(yōu)勢(shì)。目前文獻(xiàn)報(bào)道中常使用的小鼠品系多為6～10周的C57BL/6小鼠[5-7]、BALB/c小鼠[8-10]和ICR（CD-1）小鼠[11]。大鼠品系則多為8～12周的Sprague-Dawley（SD）大鼠[12-14]、僅少部分實(shí)驗(yàn)選擇Wistar大鼠[15]。小鼠經(jīng)17世紀(jì)人工培育至今，擁有數(shù)目眾多的近交系、突變系及封閉群，荷瘤或化療后產(chǎn)生的生理病理現(xiàn)象與人類(lèi)存在一定的相似性[8,16]，但由于小鼠體型較小，化療藥物劑量難以控制易致其死亡，故部分實(shí)驗(yàn)者采取大鼠作為造模對(duì)象。大鼠較小鼠性格更溫和，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)便，且對(duì)化療藥物敏感[17]，易產(chǎn)生相關(guān)不良反應(yīng)。

2 造模方式

2.1 化學(xué)療法誘發(fā)的CRF模型

臨床最常用作化療造模的藥物包括抗生素類(lèi)（阿霉素）、抗代謝類(lèi)（5-氟尿嘧啶）、生物堿類(lèi)（紫杉醇）、烷化劑類(lèi)（環(huán)磷酰胺）、細(xì)胞毒類(lèi)（奧沙利鉑、順鉑）或其中某幾種的聯(lián)合用藥方案（CAF方案：環(huán)磷酰胺，阿霉素，5-氟尿嘧啶；鉑-紫杉烷聯(lián)合化療方案等），這一部分實(shí)驗(yàn)使用沒(méi)有腫瘤的動(dòng)物模型，以避免混淆腫瘤和藥物的抗腫瘤作用之間存在的相關(guān)影響。因此，該模型可以模擬臨床癌癥患者手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后仍繼續(xù)接受化療預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的情況。

2.1.1 抗生素類(lèi) Hayward等[12]分別在第1、第3和第5天對(duì)成年雄性SD大鼠進(jìn)行單次腹腔注射15 mg/kg的阿霉素（Doxorubicin,DOX），Quinn[13]和Bredahl等[14]也選擇了相似的造模對(duì)象及方法，Park等[18]雖然同樣選擇SD大鼠（8周，200 g）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，但其造模方案為每周一次腹腔注射DOX（2 mg/kg），持續(xù)4周。de Lima等[15]則將Wistar大鼠作為研究對(duì)象，腹腔注射DOX（15 mg/kg）后發(fā)現(xiàn)模型組符合臨床惡病質(zhì)的表現(xiàn)，如體重減輕、厭食癥及全身代謝紊亂等。Zombeck等[11]選取雌性7周ICR（CD-1）小鼠，在適應(yīng)性喂養(yǎng)后的第1～3天和第10～12天腹腔注射DOX（2.5 mg/kg），模型組中DOX累積劑量為15 mg/kg。de Lima等[5]對(duì)8～10周的雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行每周2次，持續(xù)6周的DOX（2.5 mg/kg）注射進(jìn)行造模。

2.1.2 抗代謝類(lèi) Dougherty等[6]選取7～8周的C57BL/6N小鼠造模，在第7天以80 mg/kg的5-氟尿嘧啶（5-Fu）進(jìn)行腹腔注射，第14天改以60 mg/kg的5-Fu再次進(jìn)行注射。齊曉曄等[19]先將6 mg/10 ml的5-Fu溶液溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate belanced solution,PBS）中；在第1～5天通過(guò)連續(xù)向腹腔內(nèi)注射劑量為60 mg/kg的5-Fu進(jìn)行造模。Sougiannis等[7]選取10周的雄性C57BL/6小鼠，將5-Fu分3周期給藥：周期1向小鼠腹腔內(nèi)注射40 mg/kg的5-Fu，周期2、3則將5-Fu的濃度改為20 mg/kg。每周期包括5天的注射周期及9天的間隔時(shí)間，總造模周期為42天。

2.1.3 生物堿類(lèi) Loman等[8]選取7～8周的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行造模，每次向腹腔注射100 μl的濃度為30 mg/kg的紫杉醇（Paclitaxel,PTX），隔天注射，持續(xù)12天。Ray等[9]對(duì)麻醉后小鼠進(jìn)行內(nèi)眥靜脈注射PTX（10 mg/kg），每天1次，連續(xù)5天。Chaillou等[20]通過(guò)向8～11周的雌性FVB/N小鼠尾靜脈注射多西他賽（20 mg/kg）進(jìn)行造模。

2.1.4 細(xì)胞毒類(lèi) Sorensen等[10]選取6周的雄性BALB/c小鼠作為造模對(duì)象，在適應(yīng)性喂養(yǎng)后的第1、3、5、8、10和12天向小鼠腹腔內(nèi)注射奧沙利鉑（3 mg/kg）。Sakai等[21]選取8～9周，體重為23～27 g的雄性C57/6J小鼠，向小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)4天注射順鉑（3 mg/kg）。

2.1.5 烷化劑類(lèi) Crouch等[22]選取16周的雌性C57BL/6J小鼠，通過(guò)尾靜脈內(nèi)注射單次劑量300 mg/kg的環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）進(jìn)行造模。

2.1.6 聯(lián)合化療方案 Barreto等[23]選取CD2F1雄性小鼠造模，先向小鼠腹腔注射伊立替康，2 h后再注射5-Fu（每周2次，持續(xù)5周）。Wong等[24]將CTX（167 mg/kg）聯(lián)合DOX（4 mg/kg）（CA方案）作為化療方案，給雌性C57BL/ 6小鼠（10～12周，18～21 g）通過(guò)腹腔注射進(jìn)行造模。Weymann等[25]選取8～12周的雌性C57BL/6J小鼠及250～350 g的雄性SD大鼠，選取CTX、DOX和5-Fu（CAF方案）作為化療方案，分別以167 mg/kg、4 mg/kg和167 mg/kg的濃度給予小鼠和75 mg/kg、4 mg/kg和75 mg/kg的濃度給予大鼠，給藥周期均為3周內(nèi)間隔給藥4次，以誘導(dǎo)CRF模型。

2.2 腫瘤誘發(fā)的CRF模型

近一半的患者在確診時(shí)就已經(jīng)感覺(jué)疲勞，這或許是腫瘤生長(zhǎng)需要與身體其他組織的代謝競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致的[26]。腫瘤的增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致全身性炎性反應(yīng)的發(fā)生，炎性細(xì)胞因子激活NF-κB，導(dǎo)致荷瘤小鼠肌肉功能減退及力量的損失[27]，產(chǎn)生疲勞樣行為。目前實(shí)驗(yàn)中較常采用的是小鼠C26結(jié)腸腺癌細(xì)胞，人MCF-7乳腺癌細(xì)胞及小鼠Lewis肺癌細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)癌癥惡病質(zhì)模型，其中C26結(jié)腸腺癌細(xì)胞小鼠模型是目前使用最廣泛的惡病質(zhì)模型[28]，這可能與臨床腫瘤發(fā)病率、存活率及造模成功率存在一定聯(lián)系。

Norden等[29]選取10周的雌性BALB/c小鼠，向其肩胛骨皮下注射結(jié)腸26腺癌（C26）細(xì)胞（細(xì)胞密度：2.5×106個(gè)/毫升，0.2毫升/只）以模擬結(jié)腸癌癌性疲勞。Grossberg等[30]選取5種腫瘤模型探究CRF模型，分別是人乳頭瘤病毒（HPV）相關(guān)頭頸部腫瘤模型（mEER，細(xì)胞密度：1×107個(gè)/毫升，0.1毫升/只）；Lewis肺癌模型（LLC，細(xì)胞密度：5×106個(gè)/毫升，0.1毫升/只）；卵巢癌ID8模型（細(xì)胞密度：1×107個(gè)/毫升，0.1毫升/只）和IG10模型（細(xì)胞密度：1×107個(gè)/毫升，0.1毫升/只）；HPV陰性頭頸癌模型（shPTPBL/hRas；細(xì)胞密度：1×107個(gè)/毫升，0.1毫升/只），將mEER、shPTPBL和LLC細(xì)胞重懸于無(wú)菌PBS中，將ID8和IG10細(xì)胞重懸于Hank's平衡鹽溶液（Hank's Balanced Salt Solution,HBSS）中，選取10～13周的雄性C57BL/6J小鼠分別進(jìn)行注射造模。Vichaya等[31]選取mEER和LLC細(xì)胞進(jìn)行荷瘤小鼠的造模。

2.3 腫瘤加化療共同誘發(fā)的CRF模型

部分癌癥患者因?yàn)榘┌Y部位、分型或分期而無(wú)法直接進(jìn)行手術(shù)切除腫瘤，所以圍手術(shù)期化療是大多數(shù)患局部晚期癌癥患者的首選治療方法，以達(dá)到最佳治療效果提高患者存活率。除了腫瘤的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生[27]，部分化療藥物也會(huì)因其藥理作用而誘發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致疲勞的發(fā)生。

Gilliam等[32]將乳腺癌細(xì)胞（E0771）接種到卵巢被摘除的雌性C57BL/6N小鼠（12周）皮下第4對(duì)乳腺的右墊上（細(xì)胞密度：5×106個(gè)/毫升，0.1毫升/只）以模擬更年期乳腺癌患者。待腫瘤長(zhǎng)至100～150 mm3，再對(duì)其進(jìn)行單次皮下注射DOX（20 mg/kg）進(jìn)行造模。Park等[33]選取18～20g的5周齡雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，腫瘤細(xì)胞選取HT-29人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞（KCLB 30038），在熱滅活牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中于37°C下培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)皿。將在DMEM中培養(yǎng)的HT-29（細(xì)胞密度：2.5×107個(gè)/毫升，0.2毫升/只）皮下注射到小鼠的右腹，所有接種的小鼠在14天內(nèi)形成腫瘤，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到100～150 mm3時(shí)開(kāi)始造模，在28天內(nèi)通過(guò)向小鼠腹腔內(nèi)注射3次5-Fu（30 mg/kg）以造成疲勞。Ouyang等[34]發(fā)現(xiàn)荷瘤及荷瘤加化療均可成功誘導(dǎo)CRF模型，實(shí)驗(yàn)對(duì)象為16～20 g的5～6周雄性BALB/c小鼠，在RPMI 1640和基質(zhì)膠中培養(yǎng)的A549細(xì)胞（細(xì)胞密度：2.5×107個(gè)/毫升，0.2毫升/只）將會(huì)從皮下注射到小鼠的右腹造成腫瘤模型，腫瘤在7天內(nèi)形成，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到80～100 mm3時(shí)開(kāi)始進(jìn)行化療，向小鼠腹腔內(nèi)注射劑量為10 mg/kg的順鉑（每2天1次，持續(xù)3周），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)腫瘤和順鉑均可以引起疲勞，還觀察到與腫瘤本身引起的疲勞相比，順鉑誘發(fā)的疲勞發(fā)生得更早、更嚴(yán)重。

3 造模成功的評(píng)估方法

動(dòng)物的疲勞表現(xiàn)為自愿活動(dòng)減少，故目前實(shí)驗(yàn)中將重點(diǎn)放在觀察造模后動(dòng)物的自愿活動(dòng)量的改變上，主要評(píng)估方法包括：輪式跑步實(shí)驗(yàn)（自愿跑輪實(shí)驗(yàn)）、跑步機(jī)實(shí)驗(yàn)、握力試驗(yàn)、暗箱實(shí)驗(yàn)、肌肉功能及線(xiàn)粒體含量的測(cè)定等。其中輪式跑步實(shí)驗(yàn)常作為疲勞評(píng)估的主要終點(diǎn)指標(biāo)，但由于動(dòng)物種類(lèi)繁多，缺乏統(tǒng)一客觀的評(píng)估方法，故評(píng)估時(shí)多將幾種方法聯(lián)合作為結(jié)局指標(biāo)。

3.1 輪式跑步實(shí)驗(yàn)

輪式跑步實(shí)驗(yàn)自1898年由Stewart提出，至今仍是目前動(dòng)物模型中應(yīng)用最廣泛的衡量癌癥相關(guān)疲勞程度的實(shí)驗(yàn)之一[35]。自愿跑輪可以反映嚙齒動(dòng)物的晝夜節(jié)律活動(dòng)并且可以觀察到運(yùn)動(dòng)量的變化及進(jìn)食量，能在一定程度上反映出動(dòng)物的生理病理狀態(tài)。為防止動(dòng)物不適應(yīng)跑輪，研究者們一般會(huì)在實(shí)驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行至少一周的訓(xùn)練[30]，大部分實(shí)驗(yàn)造模后發(fā)現(xiàn)，模型組自愿跑輪活動(dòng)減少[11,24-25]，且跑輪時(shí)間、平均速度、最快速度及體重均明顯低于對(duì)照組[24]，但也有部分實(shí)驗(yàn)在造模結(jié)束后顯示模型組與對(duì)照組的自愿活動(dòng)沒(méi)有明顯差異[36]，這可能與動(dòng)物的種類(lèi)及品系不同有關(guān)。

3.2 跑步機(jī)實(shí)驗(yàn)

跑步機(jī)實(shí)驗(yàn)指的是在跑步機(jī)的后部放置一個(gè)帶電的金屬格，如果動(dòng)物停下來(lái)，網(wǎng)格上會(huì)有電流通過(guò)，促使它們必須不斷的跑步，通常將疲勞定義為動(dòng)物在電擊網(wǎng)格的頂部連續(xù)停留五秒鐘，同時(shí)面對(duì)反復(fù)的刺激仍不愿繼續(xù)奔跑。這種測(cè)試方法能體現(xiàn)化療誘發(fā)的疲勞樣行為[6]，并且可能更加適用于不同品系的嚙齒類(lèi)動(dòng)物，其適用范圍更廣。不過(guò)在一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠在跑步機(jī)訓(xùn)練后，肌肉功能被改善的同時(shí)，也產(chǎn)生了一定的肌肉損傷[37]，因此跑步機(jī)的實(shí)踐應(yīng)用仍需要進(jìn)行更多實(shí)驗(yàn)來(lái)加以說(shuō)明。

3.3 肌肉功能及線(xiàn)粒體含量的測(cè)定

癌癥本身及化療藥物都會(huì)引起肌肉萎縮及疲勞，導(dǎo)致氧化磷酸化速率的降低而造成線(xiàn)粒體代謝異常，骨骼肌功能減弱[27]。實(shí)驗(yàn)取材后通過(guò)評(píng)估動(dòng)物離體骨骼肌發(fā)現(xiàn)，模型組的比目魚(yú)肌及趾長(zhǎng)伸肌的功能減弱及質(zhì)量減輕，此現(xiàn)象符合CRF動(dòng)物的病理表現(xiàn)[10,12-14,21]。個(gè)別實(shí)驗(yàn)造模結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，模型組的比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)伸肌的功能及重量未見(jiàn)明顯減輕[20]，可能是藥物劑量未達(dá)到造成疲勞的程度。

4 結(jié)語(yǔ)

CRF動(dòng)物模型的建立對(duì)探究CRF的發(fā)病機(jī)制和治療方法具有重要意義。了解各種模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取標(biāo)準(zhǔn)、關(guān)鍵操作方法、主要評(píng)估方法是造模成功的關(guān)鍵。大部分實(shí)驗(yàn)在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前會(huì)進(jìn)行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，常用的藥物注射方式有腹腔注射、尾靜脈注射，少數(shù)選擇內(nèi)眥靜脈注射。雖然實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)象多為雄性大鼠或小鼠，但有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與雄性鼠相比，荷瘤雌性鼠的炎性反應(yīng)及體重減輕相對(duì)較小[38]，并且雄性比雌性更容易發(fā)生撕咬，引起局部炎性反應(yīng)，易對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不利影響，這對(duì)后期實(shí)驗(yàn)選擇模型對(duì)象提供了參考。荷瘤模型常用于觀察單由腫瘤引起的疲勞樣行為，化療誘發(fā)模型多用于觀察化療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)而引起的疲勞，荷瘤加化療的模型則是模擬臨床晚期局部腫瘤治療情況。

目前建立規(guī)范化CRF動(dòng)物模型存在的限制條件在于臨床多種癌癥均可出現(xiàn)CRF，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)一，腫瘤細(xì)胞的品系不同、化療藥物的種類(lèi)及劑量之間的差異均可對(duì)模型表現(xiàn)產(chǎn)生影響。另外嚙齒類(lèi)動(dòng)物不同品系之間也存在差異。

CRF模型建立成功的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的藥物劑量轉(zhuǎn)換。嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)之間的藥物藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)差異顯著，這種情況帶來(lái)的潛在問(wèn)題是，與人體體內(nèi)使用的劑量相比，大小鼠體內(nèi)藥物換算的劑量將會(huì)誘導(dǎo)其衰老進(jìn)而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差。此外，除了關(guān)注單次注射藥物的濃度，累積的藥物毒性也不容忽視。

單一的化療誘導(dǎo)模型或荷瘤模型難以復(fù)制臨床癌癥的復(fù)雜性，期待通過(guò)繼續(xù)探索CRF可能的發(fā)生機(jī)制和找尋合適方法建立更好的CRF動(dòng)物模型，為臨床指導(dǎo)CRF的治療研究提供理論依據(jù)。