嚴婭娟，陳新利，楊濤，王留寶，吳暉

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650032)

0 引言

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi的干燥根。具有解肌退熱，生津止渴，透疹等功效[1]。當前報道葛根的主要藥效成分為黃酮類成分葛根素等[2]，此外葛根也含有活性多糖[3]，其多糖具有抗氧化[3]、抑菌[4]及降血糖[5]等活性，但相關活性較弱。為此，欲獲得理想的活性多糖可通過對多糖分子進行一定的修飾[6]?；瘜W修飾是多糖分子修飾方法中運用最廣的一類方法，其中硫酸酯化最為常用。天然多糖因SO3-基團取代多糖分子中的羥基經(jīng)硫酸酯化修飾后，其活性受理化性質改變而改變，甚至有新的活性出現(xiàn)，其中，增強抗腫瘤活性為新出現(xiàn)活性中最常見的。當前對硫酸酯化葛根多糖(PLP)的報道還未出現(xiàn)，因此本文首先采用氯磺酸-吡啶法修飾PLP，得到硫酸酯化葛根多糖(PLPs)，進而考察其抗氧化活性、抑制H22腫瘤細胞的增殖，對免疫器官作用及對血清中IL-2 及TNF-α含量的作用，為今后開發(fā)葛根多糖提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

葛根多糖(按文獻方法制得[3])；1,1-二苯基苦基苯肼、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、吩嗦硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶I(NADH)、三吡啶吖嗪(TPTZ)購于上海Aladdin 試劑公司；四噻唑藍(MTT，美國Amresco 公司)；IL-2 及TNF-α試劑盒(南京建成生物工程研究所)；H22細胞株(上海博谷生物科技有限公司)；無水乙醇、K2SO4、氯磺酸、氫氧化鈉(NaOH)、吡啶、甲酰胺、BaCl2、三氯乙酸、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純。

實驗動物：BALB/c 雄性小鼠，體重20±2g，購于中科院上海動物中心。

1.2 儀器

UV-3600 紫外可見分光光度計(日本島津公司)，501-A 型超級恒溫器(上海實驗儀器廠有限公司)，CHRIST 凍干機(德國 Marin Christ 公司)，VS-1300L-U 超凈工作臺(蘇州安泰公司)，Nicolet IS 10 FT-IR 紅外光譜儀(美國Nicolet 公司)。

2 實驗方法

2.1 PLP 硫酸酯化衍生物制備及分析

按照參考文獻方法進行硫酸酯化反應[7]：在配有冷凝管的50mL 三口燒瓶中裝入25mL 吡啶，將三口燒瓶放置于冰浴里，將氯磺酸5.0mL 逐滴加入，并高速攪拌反應物，在滴加反應完成后，冰浴裝置撤去，即得到酯化試劑。精密稱取PLP500mg，溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺中。使其充分溶解后加入酯化試劑中，反應過程中保持恒溫水浴加熱(65℃)，分別反應1.5、2 及2.5h，反應完成后再次放置于冰浴中冷卻，加入4mol/L 的NaOH 溶液調節(jié)pH 至中性，濃縮進行反應物，加入4 倍量無水乙醇沉淀，離心(4000 r/min，30min)，沉淀物用乙醇洗滌3 次，加10mL 水溶解沉淀物，透析，濃縮，冷凍干燥，得到3 個葛根多糖硫酸酯化產(chǎn)物PLPs(PLPs1、PLPs2及PLPs3)，進行紅外掃描(4000-400cm-1)。

PLPs 中硫酸根含量采用氯化鋇-明膠法測定；硫酸基的取代度(DS)按下式計算：

式中，w 為硫的質量分數(shù)。

2.2 PLPs 體外抗氧化實驗

2.2.1 多糖對超氧陰離子自由基(·O2-)的清除作用

式中：A0為對照實驗(水代替PLP、維生素C 溶液)的吸光度；A1為樣品實驗的吸光度；A2為樣品干擾實驗(0.1M pH=7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT 溶液)的吸光度。

2.2.2 多糖對羥基自由基(·OH)的清除作用

于試管中加入不同濃度的PLP 樣品(PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及 5.0mg/mL)溶液1.0mL，分別加入2.4mL 磷酸鹽緩沖液(0.1M pH=7.4)和0.6mL H2O2 溶液(40 mmol/L)。將反應體系混合均勻，10min 后測吸光度于分光光度計230 nm 處，PLP、維生素C 溶液和H2O2 溶液用水代替，作空白實驗調零用。每個試樣做3 次平行試驗取平均值，清除率計算公式同以上式2。

2.2.3 多糖對1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除作用

于試管中加入不同濃度的PLP 樣品(PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3)及維生素C溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及 5.0 mg/mL) 1.0mL，分別加入0.2mL DPPH 溶液(0.4mmol/L)，再加入2.0mL 水。將反應體系混合均勻，30 min 后測吸光度于波長517 nm 處。用無水乙醇配制DPPH 溶液。PLP、維生素C 溶液用水代替，DPPH溶液用無水乙醇代替，作空白實驗調零用。每個試樣做3 次平行試驗取平均值。清除率計算公式同以上式2。

2.3 PLPs 體內(nèi)抑制H22 腫瘤細胞增殖實驗

從H22荷瘤小鼠腹腔中抽取腫瘤細胞液，用生理鹽水調節(jié)其細胞密度至1×106個/mL，臺酚藍試劑進行染色，于顯微鏡下觀察，細胞存活率不小于95%。取潔凈級BALB/c 的無菌雄性小鼠(20±2g)，右腹股溝皮下植入0.1mL 瘤細胞懸液。植入后，小鼠飲食自由。24 h 后，將小鼠進行隨機分組：模型組(0.9% NaCl)；陽性對照組(Cyclophosphamide，Cy，30mg/kg)；PLP、PLPs1、PLPs2及PLPs3高、低劑量組(200、100 mg/kg)，每組10 只。每天用相應藥物灌胃一次，10 天后稱取重量，將小鼠處死，各組于小鼠眼眶靜脈叢取血，離心，并分離血清，按試劑盒說明書指導操作，計算血清中TNF-α和IL-2含量。同時稱量腫瘤、脾臟及胸腺重量。計算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。

Wc 為對照組平均腫瘤重量，Wt 為實驗組平均腫瘤重量。

“江涵秋色碧潭潭，飲馬胡兒不敢南?！鼻锔邭馑畷r，站在飲馬河古渡口，看大河茫茫，奔流而下，歷史的慷慨激昂如在眼前。是誰讓我與這樣一條大河相伴，一生它都會在我夢里奔流不息。曾幾何時，兩岸蔥翠的柳條邊，被砍伐殆盡，日夜轟鳴的抽沙船，攪動著它的安寧，超載的運沙車，碾壓著坎坷的路面往來穿梭……每次路過長吉公路北線勝利橋時，看著千瘡百孔的河道和不復清澈的河水，我的內(nèi)心，都如失群的孤鳥般不停地哀泣。

2.4 統(tǒng)計學方法

將所有實驗數(shù)據(jù)用Excel 建立數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料所有數(shù)據(jù)均以±s 表示，組間樣本均數(shù)差異比較選用T 檢驗，以α=0.05 為檢驗水準。

3 結果與分析

3.1 PLPs 硫酸基取代度

PLP 及PLPs 硫含量及取代度見表1，紅外光譜圖見圖1。由圖1 可知，C-O-S 的拉伸振動為822 cm-1處的吸收峰，這是硫酸酯鍵的特征吸收峰，表明多糖鏈上已連接了硫酸基團。且PLPs3在此處的吸收峰強度高于PLPs1及PLPs2，說明PLPs3中硫酸基含量最高[9]。

由表1 可知，多糖硫含量受硫酸酯化影響而明顯增加；硫酸基含量受不同反應時間的PLPs 衍生物隨著反應時間增加的影響而增加、取代度也隨之增大。且有研究表明，硫酸酯化多糖的抗腫瘤活性受硫含量與DS 值大小的直接影響，一般認為DS 介于0.8～1.7 之間均具有良好的抗腫瘤活性[10]，取代度位0.88～1.60 之間的PLPs，按理應該具有良好的抗腫瘤活性。

表1 葛根多糖硫含量及取代度

3.2 PLP 抗氧化實驗

3.2.1 PLPs 對超氧陰離子自由基清除活性的影響

不同濃度的PLPs 對超氧陰離子自由基的清除作用結果見圖2。由圖2 可知，PLP 及硫酸化衍生物 PLP s1、PLP s2、PLP s3對O2-自由基清除活性呈一定的量效關系。PLP-3 清除O2-活性稍高于PLP、PLP s1及PLP s2，但都弱于Vc。

圖1 PLP 紅外光譜

表2 PLPs 對H22 荷瘤小鼠腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響

圖2 葛根多糖及其硫酸化組分清除O2-活性

3.2.2 PLPs 對羥基自由基清除活性的影響

不同濃度的PLP 對羥基自由基的清除作用結果見圖3。PLP 及PLPs 對·OH 自由基具有明顯的清除活性。其中，PLPs3清除·OH 自由基活性效果最強，當其濃度達到3.0 mg/mL 時，其清除率為65.6%。

圖3 葛根多糖及其硫酸化組分清除·OH 活性

3.2.3 PLPs 對DPPH·基自由基清除活性的影響

不同濃度的PLP 對DPPH·自由基的清除作用結果見圖4，圖4 表明PLP 及PLPs 對DPPH·自由基清除活性不一，但均具有清除活性。PLPs1對DPPH·自由基的清除作用效果為最弱，PLPs3清除活性最強。

圖4 葛根多糖及其硫酸化組分清除DPPH·活性

3.3 PLPs 體內(nèi)抗H22 腫瘤細胞增殖活性

表2 結果表明，PLP 及PLPs 均能抑制H22荷瘤小鼠腫瘤細胞增殖，但其活性均沒有環(huán)磷酰胺(Cy)好；未經(jīng)修飾的PLP 活性均不如3 個硫酸酯化衍生物PLPs，且其活性與取代度具有一定相關性。環(huán)磷酰胺雖然抗腫瘤活性較好，卻會顯著抑制免疫器官的作用，因而往往致使用者免疫力低下[11]。而PLP 及PLPs 均能較好提高免疫器官指數(shù)，從而可使使用者免疫能力得到改善。

3.4 PLPs 對H22 荷瘤小鼠血清TNF-α 及IL-2 含量的影響

如表2 所示，與模型組比較，陽性對照組、PLP 高劑量組及PLPs 各劑量組對荷瘤小鼠體內(nèi)TNF-α及IL-2 含量均均有顯著性提高作用，其作用趨勢與H22腫瘤抑制率成一定關聯(lián)性。

4 小結與討論

本研究表明天然葛根多糖雖具有一定抗腫瘤活性，但其活性不佳；經(jīng)硫酸酯化修飾后可顯著提高其抗腫瘤活性，且PLPs因硫酸基取代度的不同，其活性亦有一定差別。通過對本實驗中3 個不同取代度的PLPs 抗腫瘤活性的比較可知，PLPs 活性的高取代度優(yōu)于PLPs 活性的低取代度，但取代度之間的關聯(lián)性和相關范圍還需進一步研究得到證實。

機體重要免疫器官-胸腺及脾臟指數(shù)受PLP 及PLPs 影響均能得到改善，胸腺發(fā)揮免疫作用是通過產(chǎn)生T 淋巴細胞以及胸腺素；脾臟與體液免疫關系密切[12]；另外，H22荷瘤小鼠血清中IL-2及TNF-α的含量受PLP 及PLPs 影響而增加，IL-2 通過調節(jié)機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗癌活性[13]，因此，增強機體免疫機能從而發(fā)揮抗腫瘤作用可能為PLPs 抗腫瘤作用機制之一。荷瘤小鼠血清中具有強烈殺傷腫瘤細胞的TNF-α含量受PLPs 影響作用而增加，說明PLPs 亦通過促進TNF-α的釋放而發(fā)揮抗腫瘤作用。