溫軍業(yè) 張曼 范曉燕 陳旭光

T淋巴細(xì)胞(T lymphocyte)亞群的功能，在惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病中發(fā)揮著積極的重要作用[1]。在多種惡性腫瘤(如乳腺惡性腫瘤、胃惡性腫瘤、肝惡性腫瘤、食管惡性腫瘤、腸道惡性腫瘤)患者的外周血或腫瘤組織中，CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值與患者的腫瘤分化程度、生存及預(yù)后密切相關(guān)[2,3]。因此，研究T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量、分類及功能對(duì)于了解患者是否患有惡性腫瘤、免疫疾病、功能缺陷、感染性疾病及血液系統(tǒng)疾病等具有重要的意義。另外，其數(shù)值及變化規(guī)律對(duì)臨床診療、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后具有較好的臨床指導(dǎo)價(jià)值。然而，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)荷瘤小鼠不同時(shí)期T細(xì)胞的變化過(guò)程，特別是初始T細(xì)胞的變化及作用機(jī)制，這方面的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)使用流式細(xì)胞技術(shù)，對(duì)荷瘤小鼠不同時(shí)期脾臟T細(xì)胞亞群水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，其數(shù)值的變化規(guī)律，可以有效的對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行病情監(jiān)測(cè)、判斷其免疫狀態(tài)及預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 實(shí)驗(yàn)小鼠均為C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，為雌性健康小鼠，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào)：SCXK冀2013-0051)，飼養(yǎng)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物飼料及墊料均經(jīng)放射線照射滅菌。實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)：SYXK(冀)2013-1-003)。飼養(yǎng)條件為：溫度24℃～26℃，高效過(guò)濾器每5分鐘換氣1次，濕度40%～60%，每日保持12 h光照、12 h黑暗，交替進(jìn)行。選取120只健康小鼠，挑選6只正常小鼠，為無(wú)瘤組，測(cè)其無(wú)瘤狀態(tài)(Normal)的各項(xiàng)T淋巴細(xì)胞數(shù)值；其余小鼠隨機(jī)分成2組，每組57只，A組為荷瘤組，B組為對(duì)照組。所有分組小鼠背部毛發(fā)都用備皮刀去除，去毛面積約為4 cm2，75%乙醇消毒小鼠背部頸后區(qū)域皮膚。

1.2 藥品與試劑 黑色素瘤B16細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，活細(xì)胞數(shù)至少占總細(xì)胞數(shù)的96%，培養(yǎng)于保濕箱中(37.0℃，5% CO2)，培養(yǎng)液中培養(yǎng)(含10%滅活胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640)。

1.3 動(dòng)物模型 (1)無(wú)瘤組，去除毛發(fā)及消毒后，不做任何注射處理。(2)A組荷瘤組，取濃度調(diào)節(jié)好的瘤細(xì)胞懸液0.2 ml接種于荷瘤組(A組)小鼠背部頸后皮下區(qū)域。(3)B組對(duì)照組，小鼠背部頸后皮下區(qū)域注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 黑色素瘤細(xì)胞液制備：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，PBS洗滌2次，濃度控制在5×106/ml。

1.4.2 黑色素瘤荷瘤小鼠模型建立：黑色素瘤荷瘤小鼠模型建立成功的條件為皮下植瘤后7～9 d，小鼠背部頸后皮下區(qū)域可及直徑約2 mm左右質(zhì)硬黑色結(jié)節(jié)，不能活動(dòng)，界限清楚，視為建模成功。觀察荷瘤組(A組)小鼠出瘤情況，出瘤當(dāng)天(D0)從荷瘤組(A組)中，隨機(jī)選取5只用于測(cè)量繪制荷瘤曲線，剩余荷瘤組(A組)出瘤小鼠及對(duì)照組(B組)小鼠自出瘤當(dāng)天(D0)開(kāi)始，每隔5天隨機(jī)選出6只小鼠，分別處死、取出脾臟、流式儀行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，得到CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中所占比例，至荷瘤組(A組)剩余小鼠中出現(xiàn)半數(shù)以上死亡時(shí)終止試驗(yàn)觀察。

1.4.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液制備：將小鼠脫頸處死，乙醇浸泡5 min，逐層切開(kāi)小鼠腹壁，暴露脾臟，無(wú)菌分離脾臟，將脾臟放于盛有Hank’s液的滅菌EP管中剪碎，然后準(zhǔn)備好200目無(wú)菌不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)，下置無(wú)菌培養(yǎng)皿。無(wú)菌吸管吸出剪碎的脾臟組織，置于不銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)上，玻璃無(wú)菌注射器針芯研磨，培養(yǎng)基沖洗收集細(xì)胞，然后添加紅細(xì)胞裂解液裂解2 min，加入0.9%氯化鈉溶液10 ml以終止裂解，Hank’s液洗滌細(xì)胞2次，1 200 r/min離心10 min，棄去上清液，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。

1.4.4 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行脾臟淋巴細(xì)胞檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤B16細(xì)胞初期和中期的生長(zhǎng)比較 在顯微鏡下觀察黑色素瘤的培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，可于無(wú)菌培養(yǎng)瓶底見(jiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞貼與其上，呈片狀細(xì)胞團(tuán)，不能活動(dòng)；培養(yǎng)7～8 d后，細(xì)胞鋪滿瓶底，胰酶消化后細(xì)胞收縮成顆粒、球狀、可活動(dòng)的細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

培養(yǎng)3d后 培養(yǎng)7～8d后

2.2 時(shí)間對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)體積的影響 種植腫瘤前(正常)，背部硫化鈉脫毛處理，以便觀察及種植；腫瘤生長(zhǎng)階段可以分為四個(gè)階段。第一階段：D0～D9,平緩發(fā)展階段；第二階段：D9～D17緩慢增長(zhǎng)階段；第三階段：D17～D27加速度增長(zhǎng)階段；第四階段：D27，小鼠致死階段。荷瘤當(dāng)天(D0)，小鼠背部無(wú)明顯變化，小鼠背部可見(jiàn)直徑約2 mm黑斑狀，表面平坦、無(wú)隆起，小鼠活動(dòng)無(wú)異常；荷瘤第5天(D5)，小鼠背部可見(jiàn)黑色腫瘤突出表面，直徑3～5 mm，小鼠活動(dòng)無(wú)異常；荷瘤第10天(D10)，黑色腫瘤生長(zhǎng)較快，直徑增大至約10 mm，活動(dòng)略顯笨拙；荷瘤第15天(D15)，腫瘤增大至15 mm，行動(dòng)緩慢；荷瘤第20天(D20)，腫瘤增大至25 mm，較前更加緩慢；荷瘤第25天(D25)，腫瘤長(zhǎng)徑增大至約33 mm，小鼠目光呆滯、行動(dòng)極其緩慢，走路來(lái)回晃動(dòng)，不平衡，精神萎靡、背部皮膚可見(jiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，表面潰破、滲液、出血，并有血痂形成。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 時(shí)間對(duì)CD3+T、CD4+T、CD8+T及初始T細(xì)胞值的影響

2.3.1 無(wú)瘤狀態(tài)的各項(xiàng)指標(biāo)與荷瘤組A組以及對(duì)照組B組的D0的數(shù)值幾乎接近。荷瘤組和對(duì)照組，在D5、D10、D15、D20、D25時(shí)，小鼠脾臟CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中所占比例及CD4+/CD8+差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而D0時(shí)各指標(biāo)在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2 荷瘤組中， CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中所占比例及CD4+/CD8+的比例在D0、D5、D10、D15、D20、D25差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。

2.3.3 對(duì)照組中，CD8+T的比例在D0、D5、D10、D15、D20、D25間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；CD3+T、CD4+T、初始T細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+在D0、D5、D10、D15間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從D20開(kāi)始顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.4 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，D0-D25，荷瘤組和對(duì)照組，所有指標(biāo)CD3+T、CD4+T、初始T細(xì)胞以及CD4+/CD8+的比值均呈下降趨勢(shì)。從D5開(kāi)始，所有指標(biāo)顯示，荷瘤組比對(duì)照組下降得更快。見(jiàn)圖3，表1、2。

圖3 CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中的比例及CD4+/CD8+數(shù)值隨時(shí)間的變化

表1 小鼠無(wú)瘤狀態(tài)(Normal)各項(xiàng)T淋巴細(xì)胞的數(shù)值

表2 CD3+T、CD4+T、CD8+T、初始T細(xì)胞在脾淋巴細(xì)胞懸液中所占比例(%)隨時(shí)間的變化

2.4 小鼠不同時(shí)期的流式細(xì)胞圖分析 荷瘤組(A組)中，CD4+/CD8+的比例在D0、D5、D10、D15、D20、D25之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降；對(duì)照組(B組)中，CD4+/CD8+在D0、D5、D10、D15間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從D20開(kāi)始顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)于荷瘤組和對(duì)照組小鼠，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，從D5至D25，CD4+/CD8+的比值均呈下降趨勢(shì)，且下降幅度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖4。

表4 不同時(shí)期CD4+/CD8+T數(shù)值的變化

圖4 黑色素瘤小鼠不同時(shí)期的流式細(xì)胞圖；A：CD3+C；B：CD4+T；C：CD8+T；D：初始T細(xì)胞

3 討論

T細(xì)胞亞群主要包括CD4+T 細(xì)胞與 CD8+T 細(xì)胞。CD8+T是T淋巴細(xì)胞的一個(gè)亞群，活化后分化為CD8+的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)，輔助T細(xì)胞受體識(shí)別抗原并參與活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能識(shí)別腫瘤細(xì)胞，可以破壞靶細(xì)胞的膜和細(xì)胞核而起到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞是表達(dá)CD4抗原的T淋巴細(xì)胞，主要功能是輔助CD8陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞，具有不同功能的細(xì)胞群，活化的 CD4+T 細(xì)胞可以分為 CD4+的輔助性T細(xì)胞和 CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(T regulatory cell，Treg)。研究表明，CD4+的輔助性T細(xì)胞，如Th1、Th2 和 Th17細(xì)胞均具抗腫瘤免疫功能，可經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程可激活CTL，進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞[2,4]；而CD4+CD25+Treg 細(xì)胞是一種免疫抑制細(xì)胞，最多時(shí)約占正常人CD4+T細(xì)胞的10%，能特異性抑制CD8+CTL和非特異性抑制NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，具有免疫抑制性和免疫無(wú)能性，降低腫瘤免疫治療的效果，起腫瘤免疫逃逸作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[5]；CD8+T 細(xì)胞的活化部分依賴于CD4+T細(xì)胞，二者之間的平衡維持著機(jī)體正常的免疫應(yīng)答。初始T細(xì)胞是已離開(kāi)胸腺、但尚未受到其他抗原刺激的T淋巴細(xì)胞，它通過(guò)在血液和周?chē)馨推鞴?脾、淋巴結(jié))之間的再次循環(huán)，起執(zhí)行免疫監(jiān)視的功能。

本研究以黑色素瘤小鼠及正常小鼠為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群的變化，結(jié)果表明，荷瘤組小鼠CD3+T、CD4+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+降低，與劉夏青等[6-8]學(xué)者研究結(jié)果一致，與Cao等[9]研究結(jié)果不一致，其中，CD4+/CD8+T值的下降提示T 細(xì)胞亞群的紊亂，機(jī)體免疫力受到損傷，免疫狀態(tài)失衡[3]；荷瘤組小鼠CD8+T細(xì)胞水平降低，揭示荷瘤小鼠對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用較差，與肖體先等[10]學(xué)者的研究結(jié)果一致；與劉夏青等[6,11,12]研究結(jié)果不一致?？赡苡幸韵陆Y(jié)果可能：(1)機(jī)體中CD4+T的低水平導(dǎo)致大量CD8+T細(xì)胞沒(méi)有活化；(2)腫瘤惡性程度較高，荷瘤小鼠產(chǎn)生免疫耐受，導(dǎo)致 CD8+T 細(xì)胞表達(dá)降低[13]；(3)腫瘤微環(huán)境中趨化因子水平較低，浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞數(shù)量下降[14]。荷瘤組小鼠初始T細(xì)胞水平降低。對(duì)于對(duì)照組，正常小鼠在前期生長(zhǎng)過(guò)程中，T細(xì)胞亞群未發(fā)生變化，而在后期(從荷瘤第20天開(kāi)始)，CD3+T、CD4+T、初始T細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+均開(kāi)始顯著下降，考慮與老鼠胸腺功能下降、免疫力下降有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，從D5開(kāi)始，所有指標(biāo)均顯示，荷瘤組比對(duì)照組下降的更快，說(shuō)明病程發(fā)展較迅速，其中D5-D10階段是病程發(fā)展的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可視為臨床上加強(qiáng)治療和用藥的關(guān)鍵性契機(jī)。因此，監(jiān)測(cè)惡性腫瘤狀態(tài)、感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病患者的免疫功能，尤其是T淋巴細(xì)胞免疫功能的狀態(tài)及功能，對(duì)疾病的判斷、療效、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估等均具有積極意義，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞免疫治療會(huì)成為腫瘤等疾病治療研究的熱點(diǎn)[11,15-20]。