范亞磊　趙敏　鄧晟　劉瑞顯　姚煥釗　魏利輝　馮輝

摘要： 根結(jié)線蟲病長(zhǎng)期以來對(duì)獼猴桃安全生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。調(diào)查發(fā)現(xiàn)江蘇省連云港市部分獼猴桃種植園根結(jié)線蟲病發(fā)生普遍，組織切片可見根部出現(xiàn)根結(jié)線蟲誘導(dǎo)的特異的巨細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察和分子檢測(cè)結(jié)果顯示，盡管與其他群體存在一定差異，但仍確定本次分離自獼猴桃的根結(jié)線蟲（種群編號(hào)：CN43）為北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla）?；趦?nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和COⅡ-16S序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹顯示，CN43分離群體與已知的北方根結(jié)線蟲位于同一進(jìn)化分支，而與其他種類的根結(jié)線蟲明顯區(qū)分開來。以ITS序列構(gòu)建的中接網(wǎng)絡(luò)將34個(gè)北方根結(jié)線蟲分離群體劃分為10個(gè)單倍型，其中CN43屬于最大的單倍型群組;然而，單倍型分析不能確定各分離群體在地理分布上的關(guān)聯(lián)性。綜上，本研究首次報(bào)道了北方根結(jié)線蟲在中國獼猴桃上的侵染和發(fā)生，其分離群體的形態(tài)學(xué)描述和分子特征分析可為揭示獼猴桃根結(jié)線蟲的種群多樣性和種間變異提供參考。

關(guān)鍵詞： 獼猴桃;根結(jié)線蟲;北方根結(jié)線蟲;內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）;COⅡ;進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)： S436.634 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2021）01-0075-08

Morphological description and molecular characteristic analysis on Meloidogyne hapla which infect kiwifruit in Jiangsu province

FAN Ya-lei1，2， ZHAO Min1， DENG Sheng1， LIU Rui-xian3，YAO Huan-zhao4， WEI Li-hui1， FENG Hui1

（1.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，China;2.School of Horticulture and Plant Protection， Yangzhou University， Yangzhou 225009，China;3.Institute of Industrial Crops， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，China;4.Plant Protection Station of Tongshan District of Xuzhou City， Xuzhou 221116，China）

Abstract： Root-knot diseases caused by Meloidogyne spp. have posed great threat to global kiwifruit industry for a long time. It was found through investigation that， the disease caused by root-knot nematode was common in part of the kiwifruit plantations in Lianyungang City， Jiangsu province. The specific giant cells were found in tissue slices of roots， which may be induced by root-knot nematodes. Results of morphological observation and molecular detection indicated that， the root-knot nematode （population code： CN43） separated from kiwifruits was confirmed to be Meloidogyne hapla， although there was difference compared with other polulations. Phylogenetic trees inferred from internal transcribed spacer （ITS） and partial COⅡ-16S sequences revealed that， isolate population of CN43 and M. hapla were within the same clade and could be separated from other root-knot nematode species obviously. Isolates of 34 M. hapla in NCBI database were divided into ten haplotypes using median-joining network constructed by ITS sequence， in which CN43 belonged to the largest haplotype group. However， haplotype analysis could hardly show the correlation of geographic distribution between the isolates. In conclusion， infection and occurrence of M. hapla in kiwifruit trees of China was reported for the first time. Analysis on the morphology and molecular characteristics of the isolated M. hapla populations can provide reference for revealing population diversity and intraspecific variability of root-knot nematodes in kiwifruit.

Key words： kiwifruit;root-knot nematode;Meloidogyne hapla;internal transcribed spacer（ITS）;COⅡ;phylogenetic analysis

獼猴桃（Actinidia deliciosa）是起源于中國的適合在溫?zé)釒У貐^(qū)栽培的重要果樹，目前已在20多個(gè)國家得到種植，截至2011年，中國以外地區(qū)獼猴桃收獲面積達(dá)到9.4×104 hm2[1]。然而，隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)和規(guī)模的不斷發(fā)展，獼猴桃根結(jié)線蟲病害問題日益凸顯。根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）在全世界各獼猴桃種植區(qū)廣泛存在，其中南方根結(jié)線蟲（M. incognita）和北方根結(jié)線蟲（M. hapla）是主要病原線蟲種類。南方根結(jié)線蟲在巴西、智利、印度、美國、土耳其等國均有分布，北方根結(jié)線蟲則分布在巴西、智利、印度、意大利、西班牙、新西蘭、韓國等國家，在獼猴桃上存在和為害[2]。此外，其他根結(jié)線蟲種類如爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）、埃塞俄比亞根結(jié)線蟲（M. ethiopica）[3]等也能侵染獼猴桃。

根結(jié)線蟲在中國主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)期為害，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。過去30年來，南方根結(jié)線蟲是中國獼猴桃上的優(yōu)勢(shì)種群，在陜西[4]、河南[5-6]、湖北[7]、湖南[8]、貴州[9]、浙江[10]、福建[11-12]等獼猴桃產(chǎn)地普遍存在。部分獼猴桃產(chǎn)地還發(fā)現(xiàn)了爪哇根結(jié)線蟲[11]、花生根結(jié)線蟲[7]、M. actinidiae[13]和M. aberrans[2]等種類。然而，北方根結(jié)線蟲在中國獼猴桃上發(fā)生和為害的情況卻鮮有報(bào)道。

近年來，隨著中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的推進(jìn)，獼猴桃作為農(nóng)民增收脫貧的重要產(chǎn)業(yè)在江蘇省得到快速發(fā)展。本研究于2019年7月對(duì)江蘇省多個(gè)獼猴桃種植基地根結(jié)線蟲病進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)連云港部分果園的獼猴桃地上植株纖弱，葉片褪綠枯黃，坐果少，地下根系畸形，新根布滿大量珍珠狀根結(jié)，表現(xiàn)出典型的根結(jié)線蟲病的癥狀。通過病理解剖，從發(fā)病根部分離出根結(jié)線蟲。利用形態(tài)學(xué)觀察和分子檢測(cè)標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行鑒定，確定侵染獼猴桃的線蟲種類為北方根結(jié)線蟲。同時(shí)，基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和COⅡ-16S序列分析了該群體的分子特征以及與其他分離群體間的進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 線蟲分離

線蟲樣本采集自江蘇省連云港市贛榆區(qū)黑林鎮(zhèn)獼猴桃種植園。選擇長(zhǎng)勢(shì)較弱、葉片發(fā)黃的獼猴桃植株，小心挖取根組織，并選取具有典型根結(jié)癥狀的根組織帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

用清水漂洗根組織以去除泥沙，在體式顯微鏡下，用挑針從根部根結(jié)處挑取根結(jié)線蟲雌蟲和雄蟲，二齡幼蟲直接由卵塊孵化獲得。線蟲殺死、固定、會(huì)陰花紋等標(biāo)本制作參照文獻(xiàn)[13]。通過光學(xué)顯微鏡（DM2500，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品）和體式顯微鏡（M205FA，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品）觀察并拍攝雌蟲、雄蟲和幼蟲形態(tài)，測(cè)量de-Man值。

1.3 線蟲DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取參考文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行，略有修改。在解剖鏡下，挑取單條雌蟲至盛有20 μl裂解液（含1×PCR 緩沖液、1 μg蛋白酶K）的PCR管中，用鑷子將蟲體擠破使蟲液釋放，混合均勻后置于液氮中迅速冷凍20 min。隨后將樣品置于PCR儀上于65 ℃孵育30 min， 95 ℃ 5 min，最后于12 000 r/min離心1 min，吸取上清液用于PCR擴(kuò)增。

核糖體ITS序列用引物TW81（5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′）和AB28（5′-ATATGCTTAA-GTTCAGCGGGT-3′）擴(kuò)增，覆蓋3′-18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2和5′-28S rRNA序列[15]。25.0 μl反應(yīng)體系含有2×Taq Master mix（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品）12.5 μl，正反向引物各10 pmol，線蟲DNA粗提液5.0 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共38個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。線粒體細(xì)胞色素c氧化酶Ⅱ亞基基因COⅡ序列應(yīng)用C2F3（5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′）和MRH106-（5′-AATTTCTAAAGACTTTTCTTAGT-3′）擴(kuò)增，覆蓋部分COⅡ編碼序列、tRNA-His序列以及部分16S rRNA序列[16]。反應(yīng)體系同上，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，70 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。另外，利用南方根結(jié)線蟲SCAR（序列特異性擴(kuò)增區(qū)域）標(biāo)記Mi-F（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′）和Mi-R（5′-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3′）[17]，北方根結(jié)線蟲SCAR標(biāo)記Mh-F（5′-TGACGGCGGTGAGTGCGA-3′）和Mh-R（5′-TGACGGCGGTACCTCATAG-3′）[18]進(jìn)一步驗(yàn)證分離群體的種類。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后直接進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列比對(duì)和進(jìn)化分析

分別以江蘇分離群體ITS和COⅡ序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）比對(duì)，根據(jù)E值篩選相似度相近的序列以及合適外群序列構(gòu)建貝葉斯進(jìn)化樹。將新獲得的序列和下載序列通過MAFFT軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft）進(jìn)行多序列比對(duì)，再通過Gblocks 0.91b（http：//www.phylogeny.fr/one_task.cgi？task_type=gblocks）進(jìn)行策展分析并獲取保守序列。經(jīng)DAMBE軟件運(yùn)算發(fā)現(xiàn)，所有序列的核苷酸替換未達(dá)到飽和，適宜建樹?；谧钚〕喑匦畔?zhǔn)則（AIC）值，經(jīng)Modeltest 3.7計(jì)算獲得ITS序列最優(yōu)堿基替換模型為GTR+G，COⅡ最優(yōu)堿基替換模型為K81uf+G。采用馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法 （Markov chain Monte Carlo，MCMC）構(gòu)建貝葉斯樹，每條馬爾科夫鏈運(yùn)行8×105代。拋棄25%老化樣本進(jìn)行聚合評(píng)估，剩余樣本用于后續(xù)分析構(gòu)建一致性為50%的發(fā)育樹，并經(jīng)FigTree 1.4進(jìn)行優(yōu)化。另對(duì)NCBI上北方根結(jié)線蟲各分離群體ITS序列進(jìn)行重新分析，去除插入和缺失序列，最終確定34個(gè)群體樣本有11個(gè)核苷酸發(fā)生置換，基于該置換位點(diǎn)，利用Network v10構(gòu)建單倍型中接網(wǎng)絡(luò)（Median-joining network）[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 受害獼猴桃根部癥狀和線蟲形態(tài)特征

受害獼猴桃植株長(zhǎng)勢(shì)較弱，部分葉片褪綠枯黃，坐果量減少（圖1A）;地下根系不發(fā)達(dá)、畸形，新根布滿大量珍珠狀根結(jié)，表現(xiàn)出典型的根結(jié)線蟲病的癥狀（圖B）。利用酸性品紅進(jìn)行組織染色可見根結(jié)處明顯出現(xiàn)近球形根結(jié)線蟲（圖1C）。通過病理石蠟切片，可見受害植株根內(nèi)不同齡期的線蟲蟲態(tài)及根結(jié)線蟲特異誘導(dǎo)的巨細(xì)胞（圖1D、圖1E）。

在顯微鏡下對(duì)所分離的線蟲（標(biāo)記為CN43分離群體）進(jìn)行觀察，主要形態(tài)特征如下：雌蟲體型近球形，頸部短，口針纖細(xì)、基球小，錐部向背部稍彎曲，末端寬，口針基球圓形，與桿部有明顯界限;頭區(qū)大、無環(huán)紋（圖2A）;會(huì)陰花紋近圓形六邊形，背弓扁平，側(cè)線不明顯，線紋平滑形到波浪形，尾端有刻點(diǎn)（圖2B、圖2C）。雄蟲體型較短，頭冠圓、高，頭區(qū)無環(huán)紋，整個(gè)輪廓外突，與體區(qū)分界較明顯，口針椎體前端細(xì)尖，向后漸粗;口針基球球狀，與基桿界限明顯;尾端光滑鈍圓，側(cè)尾線口位于泄殖腔附近，交合刺略彎曲（圖2D、圖2E）。二齡幼蟲頭冠圓、窄，口針基球圓形，與基桿分界不明顯;尾細(xì)長(zhǎng)，末端透明區(qū)薄，界限不明顯（圖2F、圖2G）。雌蟲、雄蟲和二齡幼蟲de-Man形態(tài)學(xué)參數(shù)與已報(bào)道的北方根結(jié)線蟲（M. hapla）特征值（表1）基本一致。

2.2 分子生物學(xué)特征和進(jìn)化分析

由于在中國獼猴桃種植區(qū)南方根結(jié)線蟲普遍存在，因此首先用南方根結(jié)線蟲特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳未顯示出條帶，而以南方根結(jié)線蟲DNA為模板的陽性對(duì)照則獲得單一的995 bp左右的條帶。以ITS和COⅡ-16S通用引物PCR擴(kuò)增分別獲得553 bp（NCBI登錄號(hào)為MT490918）和663 bp條帶（NCBI登錄號(hào)為MT536934）。利用北方根結(jié)線蟲特異引物PCR擴(kuò)增獲得單一的610 bp條帶，與預(yù)期大小一致（圖3）。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CN43分離群體ITS序列與其他北方根結(jié)線蟲分離群體相似度為85.19%～99.64%，其中與中國云南分離群體（NCBI登錄號(hào)：JX024147）相似度最高，為99.64%（E值=0），而與日本分離群體（NCBI登錄號(hào)：LC030358）相似度最低，為85.19%（E值=3e-155）。CN43分離群體COⅡ-16S序列與澳大利亞分離群體（NCBI登錄號(hào)：L76262）相似度最高，為96.69%（E值=0），而與埃塞俄比亞分離群體（NCBI登錄號(hào)：KP681262）相似度最低，為92.78%（E值=0）。

基于ITS和COⅡ-16S序列構(gòu)建的貝葉斯進(jìn)化樹顯示，盡管北方根結(jié)線蟲各分離群體位于不同較短的次級(jí)分支，但總體上CN43與北方根結(jié)線蟲劃歸為一個(gè)大的進(jìn)化分支，與其他種類的線蟲位于不同分支（圖4、圖5）?；贜CBI數(shù)據(jù)庫中所有北方根結(jié)線蟲ITS序列進(jìn)行重新分析，發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)18S基因序列存在高度變異，推測(cè)這些遞交至NCBI上的序列可能不完整或不正確，因此將其排除，最終用于分析的序列共34個(gè)，包括中國分離群體20個(gè)，韓國和美國各3個(gè)，日本和澳大利亞各2個(gè)、新西蘭、塞爾維亞、西班牙、北愛爾蘭各1個(gè)。構(gòu)建的中接網(wǎng)絡(luò)共獲得10個(gè)單倍型，每個(gè)單倍型代表1～21個(gè)分離群體。其中單倍型1出現(xiàn)頻率最高（21個(gè)群體），與其他9個(gè)單倍型相連，表明這些種群可能是其他單倍型的進(jìn)化祖先。而中國[臺(tái)灣（NCBI登錄號(hào)：MK774795）、浙江（NCBI登錄號(hào)：KR535973）、云南（NCBI登錄號(hào)：MT249019）]和日本（NCBI登錄號(hào)：LC030361）、韓國（NCBI登錄號(hào)：MK188479）、澳大利亞（NCBI登錄號(hào)：AF516721）等群體存在單個(gè)獨(dú)立分支。由于無法排除測(cè)序誤差，將其分支用虛線表示;中接網(wǎng)絡(luò)圖顯示，各個(gè)單倍型和地理分布之間無明顯相關(guān)性（圖6）。

3 討論

根結(jié)線蟲在中國各個(gè)獼猴桃產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。林尤劍等[11]報(bào)道福建省獼猴桃上的根結(jié)線蟲主要為爪哇根結(jié)線蟲和南方根結(jié)線蟲，其中爪哇根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種。姜鳳麗等[10]發(fā)現(xiàn)，浙江省獼猴桃根結(jié)線蟲主要為南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲，其中南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢(shì)種。陳文等[9]對(duì)貴州獼猴桃產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查，基于雌蟲會(huì)陰花紋特征結(jié)合分子標(biāo)記鑒定出所有分離群體均為南方根結(jié)線蟲。

近年來，獼猴桃種植作為江蘇部分地區(qū)農(nóng)村振興和農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展。然而，由于大量引種和管理措施不當(dāng)，根結(jié)線蟲病逐漸成為制約當(dāng)?shù)孬J猴桃安全生產(chǎn)的重要因素之一。筆者前期對(duì)江蘇省多個(gè)獼猴桃種植基地進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分獼猴桃果園根結(jié)線蟲病發(fā)生較重，發(fā)病新根形成許多小珍珠般大小的根結(jié)，根結(jié)初與新根同色，后逐漸變?yōu)楹稚?，甚至壞死、腐爛;根際土壤蟲口密度最高可達(dá)每100 g土壤25～30條二齡幼蟲。通過SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，基于特異的電泳條帶確定其主要為南方根結(jié)線蟲，表明南方根結(jié)線蟲是為害江蘇獼猴桃的主要線蟲種類。然而基于形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，證實(shí)其中1個(gè)來自連云港的分離群體（CN43），為北方根結(jié)線蟲——這是北方根結(jié)線蟲侵染中國獼猴桃的首次報(bào)道。

本研究分離的CN43群體與其他北方根結(jié)線蟲分離群體在形態(tài)特征上基本一致，例如雌蟲會(huì)陰花紋存在刻點(diǎn)以及二齡幼蟲尾部透明區(qū)界限不明顯等。盡管如此，仍與其他分離群體的de-Man參數(shù)值存在一定差異。例如，與美國夏威夷咖啡分離群體相比，CN43群體雌蟲、雄蟲SPI值、二齡幼蟲L值和W值較大，而雌蟲MEV-HE值和二齡幼蟲a值較小[20]。與國內(nèi)記載的北方根結(jié)線蟲特征相比，CN43群體的雄蟲HH值、HW值和二齡幼蟲L值比遼寧沈陽紫花地丁分離群體大，而二齡幼蟲ST值、MEV-HE值和a值比遼寧沈陽紫花地丁分離群體小;雄蟲的HH值和a值比山東威?；ㄉ蜐?jì)南薄荷上的分離群體略小[21]。一般認(rèn)為，北方根結(jié)線蟲存在A、B 2個(gè)細(xì)胞遺傳小種，其判定依據(jù)主要根據(jù)染色體數(shù)目和雄蟲頭部特征。盡管本次獲得的CN43群體雄蟲數(shù)目十分有限，然而這些雄蟲的口針基桿與基球連接處略微變粗，與北方根結(jié)線蟲A小種雄蟲描述較為一致[22]。宋志強(qiáng)[23]曾從江蘇連云港地區(qū)蔬菜上分離到北方根結(jié)線蟲，但缺乏形態(tài)學(xué)描述和分子特征分析，尚無法確定CN43群體與侵染當(dāng)?shù)厥卟说谋狈礁Y(jié)線蟲為同一小種。

核糖體ITS和線粒體基因通常用于揭示根結(jié)線蟲中間變異特征[24-25]。盡管有研究結(jié)果表明ITS序列在根結(jié)線蟲屬內(nèi)識(shí)別率較低[26]，然而本研究結(jié)果表明，ITS和COⅡ-16S序列能較好區(qū)分北方根結(jié)線蟲和其他種類根結(jié)線蟲。同時(shí)，序列比對(duì)和貝葉斯進(jìn)化樹結(jié)果表明，CN43群體與NCBI登錄的北方根結(jié)線蟲均有高度相似性。由于NCBI數(shù)據(jù)庫中COⅡ數(shù)據(jù)十分有限，難以鑒別北方根結(jié)線蟲種間變異特征。因此，本研究采用ITS序列研究北方根結(jié)線蟲各個(gè)分離群體單倍型特征?；谥薪泳W(wǎng)絡(luò)，確定CN43與其他20個(gè)分離群體歸為一類單倍型，然而由于潛在的測(cè)序錯(cuò)誤，尚不能確定各分離群體在地理分布上的關(guān)聯(lián)性。新型分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用有望消除這些誤差，以揭示其單倍型分布規(guī)律。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-06-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31871943）; 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（18）2005]; 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院“小而特”學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目[ZX（19）6005]

作者簡(jiǎn)介：范亞磊（1994-），男，江蘇淮安人，碩士研究生，從事植物線蟲病害防治研究。

通訊作者：馮 輝，（Tel）025-84390769;（E-mail）fenghui@jaas.ac.cn