何萌萌，秦浩遠(yuǎn)，余晚鳳，褚凌渺，馮 蕊，范冬青，李 磊，柴晶晶，陳 冰，孫恩濤*

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

粉塵螨(

Dermatophagoides

farinae

)屬疥螨目(Sarcoptiformes)、麥?zhǔn)瞅?Pyroglyphidae)，是強(qiáng)烈的吸入性過敏原，其排泄物中所含的酶、蛻皮產(chǎn)生的皮屑、腺體分泌物或唾液、尸體分解時(shí)產(chǎn)生的可溶性蛋白等都具有強(qiáng)致敏性，可誘發(fā)哮喘、過敏性鼻炎、濕疹等多種過敏反應(yīng)性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，粉塵螨主要以人類或動(dòng)物身上掉下來的皮屑為食，所以廣泛分布于人類的活動(dòng)場(chǎng)所，尤其臥室居多，而減少環(huán)境中的塵螨數(shù)量或減少與塵螨的接觸時(shí)間，可以大大緩解過敏患者的癥狀，降低塵螨導(dǎo)致過敏性疾病的發(fā)病率。目前，殺螨劑主要用于防治植食性害螨，也可輔助用于室內(nèi)殺螨，是防控螨類的重要手段。有報(bào)道表明，部分化學(xué)殺螨劑因高毒高風(fēng)險(xiǎn)被逐漸淘汰，致使生物殺螨劑越來越受到重視。全球已報(bào)道具有殺蟲活性的植物提取物超過1 005種，其中39種有殺螨活性，主要包括植物粗提物、生物堿類、黃酮類、檸檬素類和植物精油類等殺螨活性成分，且防效良好。我國中草藥數(shù)量眾多、種類豐富，從中篩選出高效、經(jīng)濟(jì)、對(duì)環(huán)境友好的天然殺螨活性成分已成為研究熱點(diǎn)之一。益母草(

Leonurus

japonicus

Houtt)又名坤草，為唇形科益母草屬1年或2年生草本植物，以其地上部分的干燥全草入藥，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒之功效，臨床多用于婦產(chǎn)科疾病的治療且效果顯著。在益母草相關(guān)研究中，徐心植等研究報(bào)道了提取分離自益母草的水蘇堿和益母草堿對(duì)柑桔全爪螨有觸殺活性，且王睿研究發(fā)現(xiàn)各益母草殺螨活性物質(zhì)提取溶劑中水的提取率最高，但益母草提取物對(duì)粉塵螨的生物活性及解毒代謝酶系的影響尚未見報(bào)道。研究以水為提取溶劑，進(jìn)行室內(nèi)生物測(cè)定，對(duì)益母草提取物的殺螨活性及作用機(jī)制進(jìn)行初步探究，旨在為粉塵螨的防治及新型植物源殺螨劑的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

益母草干粉購自陜西康泰生物有限公司，密封避光保存。粉塵螨成螨源自實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)，于23.5±1 ℃、RH75%±10%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)保存。乙酰膽堿酯酶(AChE)活性檢測(cè)試劑盒和還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)試劑盒購自Solarbio公司；單胺氧化酶(MAO)試劑盒、CaMg-ATP酶活性測(cè)定試劑盒、多功能氧化酶(MFO)試劑盒、羧酸酯酶(CarE)活性測(cè)定試劑盒均購自蘇州科銘生物；BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購自上海生工。

1.2 方法

(1)藥液配置。參考高岐等利用微波加熱技術(shù)，稱取不同質(zhì)量的益母草干粉(1 g、1.5 g、2 g、2.5 g)，以去離子水為提取溶劑配置成100 mL的溶液，微波提取時(shí)間為8 min、功率為616 W，對(duì)益母草中總生物堿進(jìn)行微波提取，得到濃度分別為0.01 gDW/mL，0.015 gDW/mL，0.02 gDW/mL，0.025 gDW/mL(1 gDW/mL為1 mL水溶液中含有1 g干植物的提取物)的提取液。

(2)觸殺活性測(cè)定。改良自FAO推薦的玻片浸漬法，用雙面膠紙將活動(dòng)正常、大小一致的粉塵螨成螨背部向下粘于載玻片的一端，每玻片30頭，在各組不同濃度藥液中浸8 s后取出，用吸水紙吸去蟲體上的浮藥，放入裝有濕棉花的透明盒中再放入恒溫培養(yǎng)箱(溫度23.5 ℃，RH 70%～80%)。分別于24 h、48 h、72 h觀察其死亡情況，用毛筆尖輕觸螨體，肢體不動(dòng)者判斷為死亡。用清水做空白對(duì)照，每一濃度重復(fù)3次，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(3)熏蒸活性測(cè)定。參考FAO的方法，將粘有30頭粉塵螨成螨的玻片膠紙面朝下，斜插放入容量為1 000 mL、裝有等量不同濃度藥液的廣口試劑瓶中，注意螨體不與藥液接觸，迅速蓋上瓶蓋密封。將廣口瓶置于23.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，全黑暗條件下進(jìn)行熏蒸。每一濃度3次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照，分別觀察24 h、48 h、72 h的死亡情況，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(4)酶活性測(cè)定。從培養(yǎng)基中挑取1 000只粉塵螨成螨于1.5 mL滅菌EP管中，用以上測(cè)得殺螨活性最高濃度的益母草提取物藥液分別處理不同時(shí)間(0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)，去除螨體組織殘留藥液后用液氮充分研磨，-80 ℃保存?zhèn)溆?。乙酰膽堿酯酶(AChE)、CaMg-ATP酶、單胺氧化酶(MAO)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)和蛋白酶的活性測(cè)定分別參照各自的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒。以清水代替藥液,其余條件相同,設(shè)置對(duì)照組，處理組與對(duì)照組均重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

(5)統(tǒng)計(jì)分析。用Abbott公式對(duì)死亡率進(jìn)行校正：

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理，采用Duncan氏新復(fù)極差顯著性測(cè)驗(yàn)(Duncan's Multiple-Range Test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益母草提取物對(duì)粉塵螨的觸殺活性

浸漬法測(cè)試益母草提取物對(duì)粉塵螨的殺滅活性如表1所示。由表1可知，益母草提取物對(duì)粉塵螨有良好的觸殺活性，且觸殺活性隨處理濃度的升高而增強(qiáng)。在供試濃度為0.01 gDW/mL時(shí)，24 h校正死亡率為26.80%；而當(dāng)供試濃度為0.025 gDW/mL時(shí)，24 h校正死亡率為96.10%，與其他處理有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)益母草提取物濃度相同時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其觸殺活性也增強(qiáng)。

表1 浸漬法測(cè)試益母草提取物對(duì)粉塵螨的殺滅活性

2.2 益母草提取物對(duì)粉塵螨的熏蒸活性

通過熏蒸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益母草提取物對(duì)粉塵螨的熏蒸活性較低，不同濃度藥液處理24 h、48 h校正死亡率均低于50%，且差異不顯著(P>0.05)。在供試濃度為0.02 gDW/mL時(shí)，24 h的校正死亡率僅為5.89%，而72 h校正死亡率為39.25%(P<0.05)?？芍S著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其校正死亡率有所升高，熏蒸作用殺螨效果與作用時(shí)間呈正相關(guān)，熏蒸法測(cè)試益母草提取物對(duì)粉塵螨的殺滅活性如表2所示。

表2 熏蒸法測(cè)試益母草提取物對(duì)粉塵螨的殺滅活性

2.3 益母草提取物對(duì)粉塵螨體內(nèi)酶活性的影響

(1)對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨AChE活性的影響如圖1所示。由圖1可知，益母草提取物處理粉塵螨后，處理組與對(duì)照組AChE活性變化趨勢(shì)相似，兩組活性變化趨勢(shì)均為4 h內(nèi)上升，4～8 h降低，8～16 h活性持續(xù)升高。處理組AChE活性于16 h最高，比活力為0.456 OD·min·mL；16 h前處理組活性高于對(duì)照組,16～24 h處理組與對(duì)照組活性均降低，且處理組活性低于對(duì)照組，說明AChE被先激活后抑制。

(2)對(duì)CaMg-ATP酶活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨CaMg-ATP酶活性的影響如圖2所示。由圖2可知，CaMg-ATP酶活性總體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。20 h內(nèi)活性上升且處理組高于對(duì)照組；20～24 h內(nèi)處理組活性顯著降低，而對(duì)照組活性下降不明顯，表明對(duì)CaMg-ATP酶活性的影響為先激活后抑制。

圖1 益母草提取物對(duì)粉塵螨AChE活性的影響 圖2 益母草提取物對(duì)粉塵螨Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響注：不同小寫字母表示不同時(shí)間下對(duì)照組蟲體內(nèi)酶活性差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同時(shí)間下處理組蟲體內(nèi)酶活性差異顯著(P<0.05)。下圖同。

(3)對(duì)單胺氧化酶(MAO)活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨MAO活性影響如圖3所示。由圖3可知，處理組與對(duì)照組MAO活性在4 h內(nèi)上升，4～8 h活性下降，而后隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MAO活性變化不顯著。MAO活性在24h內(nèi)處理組均高于對(duì)照組，說明益母草提取物可激活MAO。

(4)對(duì)羧酸酯酶(CarE)活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨CarE活性影響如圖4所示。由圖4可知，CarE活性在24 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)。處理組與對(duì)照組活性變化較為相似，處理組活性在4 h內(nèi)迅速下降；4～20 h活性上下波動(dòng)；20～24 h活性急速下降，處理24 h活性降至最低。除8 h處理組活性高于對(duì)照組外，其余時(shí)間處理組活性均低于對(duì)照組，可得益母草提取物對(duì)CarE有顯著的抑制作用。

圖3 益母草提取物對(duì)粉塵螨MAO活性的影響圖4 益母草提取物對(duì)粉塵螨CarE活性的影響

(5)對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨GSTs活性的影響如圖5所示。由圖5可知，處理組GSTs活性均低于對(duì)照組，24 h內(nèi)活性變化趨勢(shì)均為下降?？傮w來看，處理組與對(duì)照組活性變化趨勢(shì)基本相同，整個(gè)過程中處理組GSTs活性均低于對(duì)照組，可得出益母草提取物使GSTs活性降低，對(duì)GSTs有抑制作用。

(6)對(duì)多功能氧化酶(MFO)活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨MFO活性的影響如圖6所示。由圖6可知，處理組與對(duì)照組MFO活性變化差異顯著。處理組MFO活性在4 h內(nèi)迅速上升，4 h MFO活性最高比活力為0.196 OD·min·mL；4～24 h MFO活性先急速降低后持續(xù)緩慢下降。8 h內(nèi)處理組MFO活性高于對(duì)照組，此后均低于對(duì)照組，說明益母草提取物對(duì)MFO活性影響表現(xiàn)為先激活后抑制。

圖5 益母草提取物對(duì)粉塵螨GSTs活性的影響圖6 益母草提取物對(duì)粉塵螨MFO活性的影響

圖7 益母草提取物對(duì)粉塵螨蛋白酶活性的影響

(7)對(duì)蛋白酶活性的影響。益母草提取物對(duì)粉塵螨蛋白酶活性的影響如圖7所示。由圖7可知，蛋白酶活性變化幅度不大，且處理組與對(duì)照組活性變化趨勢(shì)差異不明顯。8 h內(nèi)處理組蛋白酶活性高于對(duì)照組，即蛋白酶被激活；12～16 h內(nèi)處理組活性低于對(duì)照組，即酶活性被抑制；20～24 h內(nèi)活性上升，蛋白酶被再次激活，可知益母草提取物對(duì)蛋白酶活性影響較復(fù)雜，表現(xiàn)為先激活，后抑制，再激活的波動(dòng)性。

3 討論

研究采用微波法以水為提取溶劑制備供試藥液，并同時(shí)采用玻片浸漬法和熏蒸法分別測(cè)定益母草提取物對(duì)粉塵螨的觸殺活性和熏蒸活性。在觸殺活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，0.025 gDW/mL的供試藥液24 h校正死亡率為96.10%，說明益母草提取物對(duì)粉塵螨有良好的觸殺活性。0.01 gDW/mL的益母草提取物處理24 h、48 h、72 h的校正死亡率分別為26.80%、29.41%、39.25%，而0.20 gDW/mL益母草提取物處理24 h、48 h、72 h的校正死亡率分別為39.87%、60.79%、76.29%。這與表皮穿透動(dòng)力學(xué)中，穿透速度與所用藥劑的濃度成正比，并和穿透時(shí)間成指數(shù)關(guān)系的結(jié)論相同，可知濃度的升高或作用時(shí)間的延長(zhǎng)，都可使校正死亡率升高，其觸殺活性也增強(qiáng)。

熏蒸活性測(cè)定結(jié)果表明，不同濃度藥液熏蒸處理24 h、48 h、72 h的校正死亡率均低于50%，益母草提取物對(duì)粉塵螨有熏蒸活性但較低。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，校正死亡率逐漸升高，24 h、48 h、72 h后0.02 gDW/mL益母草提取物對(duì)粉塵螨的校正死亡率分別為5.89%、26.8%和39.25%。有研究表明，熏蒸活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)的結(jié)果類似，可能是由于活性物質(zhì)逐漸穿透螨體表皮層破壞其體壁結(jié)構(gòu)，抑制作用增強(qiáng)，致使粉塵螨正常生理生化代謝受阻。通過研究結(jié)果可初步推測(cè)，相較于熏蒸活性，益母草提取物對(duì)粉塵螨的觸殺活性更高。

研究已基本明確益母草提取物對(duì)粉塵螨有殺滅活性，但其殺螨作用機(jī)制尚不明確。由于殺螨機(jī)制的研究對(duì)殺螨劑的開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要，因此通過測(cè)定益母草提取物作用不同時(shí)間后，粉塵螨體內(nèi)7種酶的活性對(duì)此進(jìn)行探究。神經(jīng)毒素類殺螨劑是殺螨劑中最大的一類化合物，有研究表明大多數(shù)殺螨劑都是通過干擾神經(jīng)功能達(dá)到致死作用。乙酰膽堿酯酶(AChE)是神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，也是神經(jīng)毒素類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。研究表明，AChE先被益母草提取物激活后被其抑制，說明螨體內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)活動(dòng)先被促進(jìn)后被阻斷。益母草提取物對(duì)CaMg-ATP酶活性的影響為先激活后抑制，抑制作用可能致螨體細(xì)胞內(nèi)Ca“超載”，從而引起神經(jīng)傳遞的阻斷。單胺氧化酶(MAO)可催化一些神經(jīng)突觸的傳遞物質(zhì)神經(jīng)胺，同時(shí)是多數(shù)殺蟲劑的主要靶標(biāo)。研究中MAO被持續(xù)激活，刺激神經(jīng)傳導(dǎo)過度興奮，從而破壞神經(jīng)活動(dòng)的正常進(jìn)行。研究結(jié)果表明，益母草提取物作用于粉塵螨后，螨體內(nèi)AChE和CaMg-ATP酶都受到了一定程度的抑制，而MAO被激活，可能會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂從而導(dǎo)致粉塵螨的死亡。

羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)是昆蟲體內(nèi)三大主要解毒代謝酶系，可防御來自外界的有毒物質(zhì)。CarE和MFO對(duì)內(nèi)、外源有毒物質(zhì)的解毒代謝及殺蟲劑的抗性形成起重要作用，而GSTs具有保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等作用。研究中，益母草提取物對(duì)以上三種酶均有抑制作用，推測(cè)其作用機(jī)制是解毒酶不能與提取物中的有毒物質(zhì)結(jié)合，使益母草提取物無法在到達(dá)作用位點(diǎn)前被阻隔或降解，從而導(dǎo)致螨體內(nèi)組織損傷進(jìn)而導(dǎo)致死亡。蛋白酶是生物體內(nèi)的主要消化酶系，蛋白酶活性的升高或降低將直接影響生物體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收和利用，其影響程度與試螨在外源有毒化合物作用下(尤其在死亡前)體內(nèi)發(fā)生的一系列生理生化反應(yīng)有關(guān)。研究中蛋白酶活性表現(xiàn)為波動(dòng)性變化，推測(cè)益母草提取物能影響粉塵螨體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝活動(dòng)。

研究結(jié)果初步表明益母草提取物對(duì)粉塵螨具有觸殺活性，熏蒸活性較弱；推測(cè)其作用機(jī)制與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，也與解毒代謝活動(dòng)關(guān)聯(lián)。對(duì)此筆者會(huì)繼續(xù)研究，為將益母草進(jìn)一步開發(fā)為特異性高、對(duì)人畜安全、低毒且長(zhǎng)期使用不易產(chǎn)生抗藥性的新型綠色環(huán)保殺螨劑提供理論基礎(chǔ)。