張群 蔡彭 楊妍 朱超莽 周士祥 張蕾 殷紅梅 李紅偉 李多杰

【摘要】 目的：探討PD-1和PD-L1在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）腫瘤組織中的表達(dá)情況及與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。方法：回顧性分析2012年1月-2016年12月于本院行食管癌根治性R0切除的139例Ⅲ期ESCC患者的病歷資料。通過免疫組織化學(xué)（IHC）法分析139例的ESCC腫瘤組織與其中50例的癌旁組織（距腫瘤切緣>5 cm）中的PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)，研究其表達(dá)情況與患者臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：ESCC腫瘤組織內(nèi)PD-1、PD-L1蛋白陽性表達(dá)率均較癌旁組織高（18.7% vs 0，40.3% vs 22.0%，P<0.05）。不同PD-1、PD-L1表達(dá)情況患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)（N）分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，PD-1陽性表達(dá)患者與PD-1陰性表達(dá)患者總生存率（overall survival rate，OS）及無病生存率（disease-free survival rate，DFS）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;PD-L1陽性表達(dá)患者OS、DFS較PD-L1陰性表達(dá)患者均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Cox回歸分析結(jié)果顯示，PD-L1蛋白表達(dá)是ESCC患者的獨(dú)立預(yù)后因子。結(jié)論：PD-1的表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后無明顯相關(guān)性，而PD-L1在食管鱗癌中的高表達(dá)與患者更差的預(yù)后相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 食管鱗癌 PD-1 PD-L1 預(yù)后

Study on Expression of PD-1 and PD-L1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Its Correlation with Prognosis of Patients/ZHANG Qun， CAI Peng， YANG Yan， ZHU Chaomang， ZHOU Shixiang， ZHANG Lei， YIN Hongmei， LI Hongwei， LI Duojie. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： 0-032

[Abstract] Objective： To analyze the expression of PD-1 and PD-L1 in esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） and the relationship between the expressions of PD-1， PD-L1 and the clinicopathological characteristics and prognosis of the patients. Method： The data of 139 patients with ESCC in stage Ⅲ who underwent radical R0 resection of esophageal carcinoma in our hospital from January 2012 to December 2016 were retrospectively analyzed. Immunohistochemistry （IHC） was used to analyze 139 cases of ESCC and 50 cases of paracancerous tissues （>5 cm from the margin of tumor）， and the relationships between the expression of PD-1， PD-L1 and clinicopathological characteristics and prognosis of patients were analyzed. Result： The positive expression rates of PD-1 and PD-L1 proteins in ESCC tumor tissues were higher than those in para-cancer tissues （18.7% vs 0， 40.3% vs 22.0%， P<0.05）. There were no significant differences in age， gender， tumor site， degree of differentiation and lymph node （N） stage among patients with different PD-1 and PD-L1 expressions （P>0.05）. Kaplan-Meier survival analysis showed that there were no significant differences in overall survival rate （OS） and disease-free survival rate （DFS） between PD-1 positive patients and PD-1 negative patients （P>0.05）. OS and DFS in PD-L1 positive expression patients were significantly lower than those in PD-L1 negative expression patients， and the difference were statistically significant （P<0.05）. Cox regression analysis showed that PD-L1 protein expression was an independent prognostic factor in ESCC patients. Conclusion： The expression of PD-1 is not significantly correlated with the prognosis of patients with ESCC， while the high expression of PD-L1 in ESCC is correlated with the worse prognosis of patients.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma PD-1 PD-L1 Prognosis

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu 233004， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.007

近年來，在全球范圍內(nèi)食管癌的發(fā)病率逐年升高，其發(fā)病率、病死率分別居第4、6位[1-2]。在我國所有食管癌中，食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占其中的90%左右[3]。雖然同步放化療、免疫及靶向治療在食管癌的治療方面已取得了突破性進(jìn)展，但其局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍然較高，文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道患者5年生存率僅為30%左右。PD-1屬于免疫球蛋白超家族CD28成員，表達(dá)部位主要位于T細(xì)胞、DC細(xì)胞與B細(xì)胞的細(xì)胞膜。PD-L1的表達(dá)部位以激活態(tài)T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與其他部分腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜為主[6]。信號通路PD-1/PD-L1的激活會導(dǎo)致活化的T細(xì)胞衰竭，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[7-9]。目前，已有多項(xiàng)研究表明相比于正常食管組織，ESCC患者中PD-1和PD-L1表達(dá)量增高，但這些差異表達(dá)和患者生存預(yù)后的相關(guān)性仍存在較大爭議。因此，本文旨在研究ESCC患者病理組織中PD-1/PD-L1蛋白的表達(dá)水平，研究其表達(dá)情況和患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，以期為食管癌的治療提供新線索?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2012年1月-2016年12月于本院行食管癌根治性R0切除的139例Ⅲ期ESCC患者的病歷資料。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療前行內(nèi)鏡下組織活檢，經(jīng)病理確診為ESCC;②經(jīng)影像學(xué)、消化道鋇餐造影、超聲內(nèi)鏡等檢查證實(shí)為Ⅲ期ESCC;③均為初次治療;④無其他系統(tǒng)（如心、肺、腎、腦等）嚴(yán)重合并癥，無手術(shù)禁忌證;⑤臨床病理和隨訪資料完備。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行新輔助放化療;②術(shù)前卡氏評分（KPS評分）<70分。同時(shí)選取其中50例的癌旁組織進(jìn)行對照研究。收集患者年齡、性別、腫瘤分化級別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤部位等數(shù)據(jù)。本研究涉及的所有組織標(biāo)本均來自本院病理組織庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗PD-1/PD-L1單抗（劍橋Abcam公司，英國），多克隆過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG（中國福州麥心生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 PD-1/PD-L1表達(dá)的檢測

1.3.1 組織芯片 對腫瘤組織與其癌旁組織先進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）獨(dú)立染色，再通過福爾馬林固定，接著采取石蠟包埋（FFPE）處理，并由兩名病理學(xué)專家進(jìn)行雙重檢查。用石蠟組織塊構(gòu)建了139例病例和50個(gè)對照標(biāo)本的組織微陣列。從每個(gè)標(biāo)本的FFPE組織塊中取出直徑2 mm的區(qū)域。切下一系列4 μm厚的切片，并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)移到載玻片上進(jìn)行免疫組化染色。

1.3.2 免疫組化 通過兔抗PD-1/PD-L1單抗開展IHC染色，用來對PD-1/PD-L1組織表達(dá)進(jìn)行評估。將組織微陣列去石蠟并再水化，再對切片實(shí)施中和內(nèi)源性過氧化物酶（PO）處理，最后通過山羊封閉血清完成封閉處理。隨后將樣品與PD-1/PD-L1抗體結(jié)合，和多克隆PO偶聯(lián)的抗兔IgG同時(shí)接受20 min孵育。最后，通過蘇木精對玻片實(shí)施復(fù)染處理。

1.3.3 免疫染色評估 在低倍鏡（×100）下檢查免疫組織化學(xué)結(jié)果，對于陽性染色的切片，以高放大倍數(shù)確定在每個(gè)選定視野中顯示高和低染色的腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度和比例。研究中使用的免疫反應(yīng)評分模式（ISP）是強(qiáng)度類別和比例類別的組合[10]，強(qiáng)度類別等級為0分（藍(lán)紫色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）和3分（棕褐色），比例類別等級為0分（小于1%），1分（1%～30%），2分（31%～60%）和3分（61%～100%）。通過將強(qiáng)度類別等級與比例類別等級相乘得出最終得分，分值0～9分，ISP<3分為陰性，ISP≥3分為陽性。兩名病理學(xué)專家對腫瘤樣本進(jìn)行獨(dú)立雙盲審查并進(jìn)行了評分，對于有爭議的標(biāo)本進(jìn)行討論直到達(dá)成共識。

1.4 隨訪 術(shù)后2年內(nèi)，每3～6個(gè)月進(jìn)行1次復(fù)查，2年后隨訪1次/年，直至死亡，將全因死亡（或疾病進(jìn)展）作為隨訪終點(diǎn)事件，在隨訪時(shí)間上，中位值是29.5個(gè)月，結(jié)束隨訪的時(shí)間是2019年12月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過字2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析PD-1、PD-L1蛋白的表達(dá)情況和患者臨床病理特征間的關(guān)聯(lián)性。通過Kaplan-Meier方法比較PD-1、PD-L1陰性表達(dá)與陽性表達(dá)兩組患者的OS和DFS差異。通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型篩選影響ESCC患者預(yù)后的相關(guān)因子。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC腫瘤組織中PD-1/PD-L1的表達(dá)情況 139例ESCC組織中，PD-1陽性26例（18.7%），陰性113例（81.3%）;PD-L1陽性56例（40.3%），陰性83例（59.7%）。50例癌旁組織，無PD-1陽性，陰性50例（100%）;PD-L1陽性11例（22.0%），陰性39例（78.0%）。相比于癌旁組織，PD-1、PD-L1在ESCC的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)（或兩者）中均過表達(dá)（P<0.05）。

2.2 PD-1、PD-L1與ESCC臨床病理特征的關(guān)系 不同PD-1、PD-L1表達(dá)情況患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)（N）分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1、2。

2.3 ESCC患者的預(yù)后多因素分析及PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)的預(yù)后價(jià)值 通過Cox多因素模型分析影響患者OS、DFS的因素，結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、PD-L1表達(dá)均是OS、DFS的獨(dú)立預(yù)后因子（P<0.05），見表3、4。PD-1的表達(dá)不是OS、DFS的獨(dú)立預(yù)后因子（P=0.518、0.602），見圖1。PD-L1陽性表達(dá)患者OS（中位OS為22.4個(gè)月）和DFS（中位DFS為18.7個(gè)月）較PD-L1陰性表達(dá)患者（中位OS為43.2個(gè)月，中位DFS為41.4個(gè)月）均顯著降低（P<0.05），見圖2。N0患者，PD-L1陽性表達(dá)患者OS（中位OS為28.7個(gè)月）與DFS（中位DFS為24.5個(gè)月）較PD-L1陰性表達(dá)患者均低（P<0.05）;N+患者，PD-L1陽性表達(dá)患者OS（中位OS為17.2個(gè)月）與DFS（中位DFS為16.6個(gè)月）與PD-L1陰性表達(dá)患者（中位OS為22.1個(gè)月，中位DFS為19.4個(gè)月）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

3 討論

PD-1和PD-L1的結(jié)合會傳遞機(jī)體免疫抑制相關(guān)信號，屬于抑制性的協(xié)同刺激分子，并抑制T淋巴細(xì)胞的活化，抑制T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤增殖轉(zhuǎn)移[11-15]。但在ESCC中，患者腫瘤組織中的PD-1、PD-L1的表達(dá)與患者的臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性仍然未知，雖然既往大量研究進(jìn)行了探索，但各個(gè)研究之間報(bào)道的結(jié)果仍存在較大爭議。因此，本項(xiàng)研究通過回顧性分析139例ESCC術(shù)后標(biāo)本，探討PD-1、PD-L1表達(dá)在局部可切除的Ⅲ期ESCC患者中的臨床意義及預(yù)后價(jià)值，以期為食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后提供預(yù)測指標(biāo)。

本研究通過ISP法進(jìn)行腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達(dá)的評估，總體PD-1、PD-L1陽性表達(dá)率分別為18.7%、40.3%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，不同PD-1、PD-L1表達(dá)情況患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)（N）分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但PD-L1高表達(dá)是影響ESCC患者OS、DFS的獨(dú)立預(yù)后因子（P<0.05）。相比于PD-L1陰性表達(dá)患者，PD-L1陽性患者OS與DFS均明顯降低（P<0.05）。提示PD-L1的表達(dá)與患者較差的預(yù)后有關(guān)。目前PD-L1過表達(dá)導(dǎo)致ESCC患者預(yù)后不良的機(jī)制仍不清楚，有研究表明PD-L1表達(dá)會加深腫瘤浸潤深度，從而促進(jìn)局部進(jìn)展[16-18]。李琦等[19]通過回顧性分析87例食管鱗癌患者PD-1/PD-L1表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果表明，PD-L1的表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤位置、腫瘤形態(tài)、TNM分期均無明顯相關(guān)性，且其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)組1、2、3年生存率分別為32%、12%、12%，顯著低于PD-L1低表達(dá)組的59.8%、35.0%、28.7%，PD-L1高表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)為PD-L1低表達(dá)的患者的1.587倍，是影響食患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因子。隋啟海等[20]收集325例行手術(shù)切除的食管癌患者的臨床資料并通過免疫組化的方法分析了腫瘤組織和部分癌旁組織中PD-1、PD-L的表達(dá)，結(jié)果表明，PD-1、PD-L1陽性表達(dá)率分別為12.0%、52.6%，PD-1、PD-L1的表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、腫瘤位置、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性，生存分析方面顯示，PD-1陰性表達(dá)患者與PD-1陽性表達(dá)患者總生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.500），但是在隨訪期內(nèi)存活組的PD-L1陽性表達(dá)率明顯低于死亡組。以上結(jié)果與本研究是一致的，均提示腫瘤組織中PD-L1的過表達(dá)是ESCC切除術(shù)后患者生存的獨(dú)立預(yù)后因子。

此外，在本項(xiàng)研究中按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)分類，N+患者，PD-L1陽性表達(dá)患者OS（中位OS為17.2個(gè)月）與DFS（中位DFS為16.6個(gè)月）與PD-L1陰性表達(dá)患者（中位OS為22.1個(gè)月，中位DFS為19.4個(gè)月）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。分析原因可能是在癌癥的晚期階段，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對患者預(yù)后的影響遠(yuǎn)大于PD-L1的表達(dá)，提示針對不同淋巴結(jié)分期的ESCC患者，PD-L1表達(dá)對患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值存在局限性，顯示出對早期ESCC預(yù)后價(jià)值更高。

綜上，ESCC腫瘤組織中PD-1、PD-L1蛋白陽性表達(dá)率顯著增加，其表達(dá)和患者臨床病理特征之間無顯著關(guān)聯(lián)。但是PD-L1可作為ESCC患者OS、DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，尤其對于N0的患者，PD-L1的高表達(dá)與患者更差的預(yù)后相關(guān)，但這一結(jié)論仍需要進(jìn)一步的大規(guī)模，多中心的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] Rustgi A K，El-Serag H B.Esophageal carcinoma[J].N Engl J Med，2014，371：2499-2509.

[2] Siegel R L，Miller K D，Jemal A.Cancer statistics，2020[J].CA Cancer J Clin，2020，70（1）：7-30.

[3] Chen W，Zheng R，Baade P D，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66：115-132.

[4] CHEN W，ZHENG R，ZENG H，et al.Annual report on status of cancer in China，2011[J].Chin J Cancer Res，2015，27：2-12.

[5] Short M W，Burgers K G，F(xiàn)ry V T.Esophageal Cancer[J].Am Fam Physician，2017，95（1）：22-28.

[6] Hansen J D，Du Pasquier L，Lefranc M P，et al.The B7 family of immunoregulatory receptors：a comparative and evolutionary perspective[J].Mol Immunol，2009，46：457-472.

[7] Francisco L M，Salinas V H，Brown K E，et al.PD-L1 regulates the development， maintenance， and function of induced regulatory T cells[J].J Exp Med，2009，206：3015-3029.

[8] Sanmamed M F，Chen L.Inducible expression of B7-H1（PD-L1） and its selective role in tumor site immune modulation[J].Cancer J，2014，20：256-261.

[9] Pardoll D M.The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy[J].Nat Rev Cancer，2012，12：252-264.

[10] QIAO W，F(xiàn)AN F，F(xiàn)EI W，et al.PD-L1 Expression On tumor Cells Was Associated With Unfavorable Prognosis In Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J].J Cancer，2018，9：2224-2231.

[11] Seliger B.Basis of PD1/PD-L1 Therapies[J].J Clin Med，2019，8（12）：2168.

[12] REN D，HUA Y，YU B，et al.Predictive biomarkers and mechanisms underlying resistance to PD1/PD-L1 blockade cancer immunotherapy[J].Mol Cancer，2020，19（1）：19.

[13] WANG Z，WU X.Study and analysis of antitumor resistance mechanism of PD1/PD-L1 immune checkpoint blocker[J].Cancer Med，2020，9（21）：8086-8121.

[14] Mazieres J，Drilon A，Lusque A，et al.Immune checkpoint inhibitors for patients with advanced lung cancer and oncogenic driver alterations：results from the IMMUNOTARGET registry[J].Ann Oncol，2019，30（8）：1321-1328.

[15] WANG L，MA Q，YAO R，et al.Current status and development of anti-PD-1/PD-L1 immunotherapy for lung cancer[J].Int Immunopharmacol，2020，79：106088.

[16] Poggio M，Hu T，Pai C C，et al.Suppression of Exosomal PD-L1 Induces Systemic Anti-tumor Immunity and Memory[J].Cell，2019，177（2）：414-427.

[17] YU H，Boyle T A，ZHOU C，et al.PD-L1 Expression in Lung Cancer[J]. J Thorac Oncol，2016，11（7）：964-975.

[18] WANG X，TENG F，KONG L，et al.PD-L1 expression in human cancers and its association with clinical outcomes[J].Onco Targets Ther，2016，9：5023-5039.

[19]李琦，李濤，范羽，等.PD-1/PD-L1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].腫瘤預(yù)防與治療，2018，31（4）：248-257.

[20]隋啟海，詹成，馬可，等.食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中PD-1/PD-L1/PD-L2的表達(dá)與臨床因素及預(yù)后的相關(guān)性[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2020，47（1）：76-82，100.

（收稿日期：2021-08-23） （本文編輯：程旭然）