張 亮， 王 斌， 陳東風(fēng)

陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400042

根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌已成為全球第五大惡性腫瘤，居于癌癥死亡原因的第3位[1-2]。在我國(guó)，由于幽門螺桿菌感染、不良飲食習(xí)慣、早期內(nèi)鏡篩查的不足等，胃癌的發(fā)生率和死亡率仍處于很高的水平，居于消化系統(tǒng)惡性腫瘤致死病因的首位[3-4]。目前，外科手術(shù)治療仍是胃癌治療的首選方式，值得欣慰的是Ⅰ期胃癌患者早期手術(shù)切除后的5年存活率為90%左右[5]。但由于胃癌發(fā)病十分隱匿，早期癥狀不明顯，因此很多胃癌患者確診時(shí)已處于晚期或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。使得這些胃癌晚期的患者手術(shù)治療效果很差，即使手術(shù)切除腫瘤和放化療治療，其5年生存率仍不超過(guò)30%[6-8]?？梢?，胃癌已成為嚴(yán)重危害我國(guó)居民健康的重要疾病。但胃癌的發(fā)生發(fā)展等分子機(jī)制仍不十分清楚，因此，積極尋找胃癌的潛在預(yù)后指標(biāo)或分子標(biāo)志物，有可能為胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供新的策略。

基因芯片技術(shù)是一種能夠快速獲得大量基因表達(dá)圖譜的高通量測(cè)序技術(shù)。所得數(shù)據(jù)能夠儲(chǔ)存在公共的數(shù)據(jù)庫(kù)中[9]，因此，通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析這些數(shù)據(jù)，可能會(huì)發(fā)掘出大量有價(jià)值的信息，以有助于癌癥的研究。在此項(xiàng)研究中，通過(guò)對(duì)三組胃癌相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的差異基因INHBA。INHBA基因編碼激活素或者抑制素的βA亞基，參與機(jī)體的生殖和發(fā)育等過(guò)程[10]。已有研究表明，INHBA的高表達(dá)與人類多種癌癥密切相關(guān)，如食管癌、結(jié)腸癌、肺癌等，可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[11-13]。但I(xiàn)NHBA的表達(dá)在胃癌發(fā)病中的作用少有報(bào)道，因此，我們擬研究INHBA基因的表達(dá)與胃癌臨床分期和預(yù)后的關(guān)系，以揭示其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 篩選GEO芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌芯片通過(guò)GEO公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行檢索[14]，檢索胃癌相關(guān)基因芯片GSE79973、GSE13911、GSE19826。3個(gè)基因芯片均是基于GPL570平臺(tái)[(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]?；蛐酒珿SE79973含有10例胃癌組織和10例正常胃黏膜組織?；蛐酒珿SE13911含有38例胃癌組織和31例正常胃黏膜組織?；蛐酒珿SE19826含有12例胃癌組織和12例正常胃黏膜組織。三組芯片共含有胃癌組織樣本60例和正常對(duì)照樣本53例。

1.2 篩選差異表達(dá)的基因通過(guò)GEO2R分析工具進(jìn)行分析，設(shè)置正常胃黏膜組織和胃癌組織兩組進(jìn)行比較。下載GEO2R分析的結(jié)果數(shù)據(jù)?；虮磉_(dá)差異倍數(shù)在2倍以上(logFC>2或logFC<-2)且P<0.05，認(rèn)為是差異表達(dá)顯著的基因。

1.3 文恩圖繪制差異表達(dá)基因logFC>0的為上調(diào)差異基因，logFC<0的為下調(diào)差異基因。分別將三組基因芯片的上調(diào)基因和下調(diào)基因通過(guò)在線文恩圖軟件(Venny 2.1.0)進(jìn)行文恩圖繪制，篩選三組芯片共同的差異表達(dá)基因。

1.4 INHBA基因在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)分析通過(guò)GEPIA、LinkedOmics、UALCAN在線分析軟件分析INHBA基因在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況。GEPIA是基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析的在線交互式數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)也是腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析的工具，可分析TCGA中32種癌癥的測(cè)序數(shù)據(jù)[16]。UALCAN也是一個(gè)有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的數(shù)據(jù)庫(kù)，主要是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[17]。通過(guò)輸入目的基因INHBA，設(shè)置胃癌和正常對(duì)照組，獲得目的基因在兩組的表達(dá)情況。主要分析INHBA基因在胃癌組織、不同胃癌組織亞型、臨床的不同分期、胃癌的TNM分期中的表達(dá)差異。

1.5 INHBA基因的生存預(yù)后分析Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kmplot.com/)是一種生存分析數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠根據(jù)TCGA和微陣列芯片的數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系[14]。運(yùn)用Kaplan-Meier Plotter分析INHBA基因的表達(dá)與胃癌患者總生存時(shí)間、無(wú)疾病進(jìn)展期的關(guān)系。以及根據(jù)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的表達(dá)情況，分析INHBA基因表達(dá)與胃癌患者生存時(shí)間的關(guān)系。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析基因蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具(search tool for the retrieval of interacting genes，STRING)是分析已知蛋白的相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)[18]。運(yùn)用STRING在線分析網(wǎng)站(http://string-db.org/)，分析INHBA基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。然后通過(guò)Cytoscope軟件中的MCODE(molecular complex detection)插件對(duì)相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類功能模塊分析[19]，以分析INHBA相互作用蛋白的調(diào)控關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和正常胃黏膜組織中差異基因的篩選

通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的GEO2R在線分析平臺(tái)選取并下載三組芯片GSE79973、GSE13911、GSE19826進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，GSE79973芯片中分析出差異基因共563個(gè)，其中上調(diào)差異基因142個(gè)，下調(diào)差異基因421個(gè)；GSE13911芯片中分析出差異基因共390個(gè)，其中上調(diào)差異基因100個(gè)，下調(diào)差異基因290個(gè)；GSE19826芯片中分析出差異基因共335個(gè)，其中上調(diào)差異基因85個(gè)，下調(diào)差異基因250個(gè)。然后通過(guò)維恩圖軟件(Venn)合并和繪制三組樣本中共同的差異基因，結(jié)果共得到共表達(dá)的差異基因158個(gè)，其中上調(diào)差異基因32個(gè)，下調(diào)差異基因126個(gè)(見圖1)。

圖1 三組基因芯片樣本中共同上調(diào)差異基因(A)和下調(diào)差異基因(B)的Venn模式圖Fig 1 Venn pattern maps of up-regulated differential genes (A) and down-regulated differential genes (B) in three groups of gene chip samples

2.2 胃癌組織和正常胃黏膜組織中差異基因的熱圖分析考慮到上調(diào)的差異基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的促進(jìn)作用，且更適合作為一種診斷檢測(cè)指標(biāo)，因此，我們主要研究上調(diào)的差異表達(dá)基因。將32個(gè)上調(diào)的基因按照表達(dá)差異的倍數(shù)進(jìn)行排序，繪制差異基因的熱圖，以獲得差異表達(dá)最顯著的基因(見圖2)。通過(guò)熱圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜組織相比，COL11A1和INHBA這兩個(gè)基因在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)最明顯。由于已有研究報(bào)道COL11A1基因在胃癌中的異常高表達(dá)和臨床意義[20]，因此，本研究主要探索INHBA基因在胃癌中的表達(dá)和臨床意義。

圖2 上調(diào)差異表達(dá)基因的熱圖分析(部分結(jié)果)Fig 2 Differentially expressed genes in gastric cancer and heat map (partial results)

2.3 INHBA基因在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)

通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析驗(yàn)證INHBA在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，INHBA在胃癌中的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)(見圖3A)。進(jìn)一步，我們通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析INHBA基因表達(dá)與胃癌亞型的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，除了在印戒細(xì)胞癌中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，INHBA基因在其他幾種胃癌類型中均呈顯著高表達(dá)(P<0.05)(見圖3B)。

圖3 INHBA基因在正常胃黏膜、胃癌組織(A)和不同胃癌組織亞型(B)中的差異性表達(dá)Fig 3 Differential expression of INHBA gene in normal gastric mucosa, gastric cancer tissues (A) and different gastric cancer tissue (B)

2.4 INHBA基因與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性通過(guò)GEPIA和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)分析INHBA基因在不同胃癌臨床分期中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，INHBA的表達(dá)與臨床分期和T分期呈顯著正相關(guān)。INHBA在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ期(見圖4A～4B)。另外，INHBA基因的表達(dá)與胃癌的T分期也有明顯相關(guān)性，INHBA在T2、T3、T4期中的表達(dá)量明顯高于其在T1期中的表達(dá)(見圖4C)。但I(xiàn)NHBA的表達(dá)與胃癌N分期和M分期無(wú)相關(guān)性(見表1)。這部分結(jié)果提示INHBA的表達(dá)上調(diào)可能與胃癌腫瘤的大小有關(guān)。

圖4 INHBA基因與胃癌臨床分期(A～B)和T分期(C)的相關(guān)性Fig 4 Correlation between INHBA gene and clinical stage (A-B) and T stage (C) of gastric cancer

表1 INHBA的表達(dá)與胃癌臨床特征之間的相關(guān)性Tab 1 The correlation between the expression of INHBA and the clinical features of gastric cancer

2.5 INHBA基因表達(dá)對(duì)胃癌患者臨床預(yù)后的影響通過(guò)LinkedOmics和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析INHBA基因的表達(dá)與胃癌患者總生存期、無(wú)疾病生存期、HER2表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，INHBA基因高表達(dá)組的胃癌患者總生存期和無(wú)疾病生存期均明顯較INHBA低表達(dá)組的患者時(shí)間短(見圖5A～5B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明INHBA基因高表達(dá)預(yù)示著胃癌患者較差的臨床預(yù)后。另外，HER2陽(yáng)性與陰性胃癌患者的生存分析中發(fā)現(xiàn)，HER2陰性患者中INHBA基因的表達(dá)高低對(duì)生存期無(wú)影響。但在HER2陽(yáng)性胃癌患者中，INHBA基因高表達(dá)的患者生存期明顯短于INHBA低表達(dá)的患者(見圖5C～5D)。

圖5 INHBA表達(dá)在總生存期(A)、無(wú)疾病生存期(B)、HER2表達(dá)陰性(C)、HER2表達(dá)陽(yáng)性(D)胃癌患者生存期中的預(yù)后價(jià)值Fig 5 The prognostic value of INHBA expression in the survival (A), disease-free survival (B), HER2 negative expression (C) and HER2 positive expression (D) patients with gastric cancer

2.6 INHBA基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)為了尋找INHBA可能參與的信號(hào)調(diào)控通路，運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析其蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，INHBA相互作用的蛋白主要有激活素A受體類型(activin A receptor，ACVR)：ACVR1、ACVR1B、ACVR1C、ACVR2A、ACVR2B和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)通路中的：TGFB2、SMAD2、SMAD3、SMAD4等分子(見圖6A)。通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析也發(fā)現(xiàn)，INHBA主要參與的信號(hào)通路包括TGF-β信號(hào)通路，調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路和細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用的通路。為了進(jìn)一步明確INHBA與這些信號(hào)通路分子的相互調(diào)控關(guān)系，我們通過(guò)GEPIA網(wǎng)站分析了INHBA的表達(dá)與它們的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，INHBA的表達(dá)與SMAD2、SMAD3、SMAD4呈正相關(guān)(見圖6B～6D)。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明INHBA是一種促癌基因，可能通過(guò)正向調(diào)節(jié)SMAD2、SMAD3、SMAD4的表達(dá)參與TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控。

圖6 INHBA基因相關(guān)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(A)及與SMAD2(B)、SMAD3(C)、SMAD4(D)的表達(dá)相關(guān)性分析Fig 6 INHBA protein interaction network (A) and its correlation with SMAD2 (B), SMAD3 (C), SMAD4 (D) expressions

3 討論

胃癌的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，包括遺傳因素、幽門螺桿菌感染、飲食、環(huán)境等。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和幽門螺桿菌的根除等，胃癌的總體發(fā)病率有所下降，但胃癌的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)仍高居于惡性腫瘤中的第2位，其新發(fā)病例和死亡病例約占全球的42.6%和45.0%[3]。早期發(fā)現(xiàn)和診治對(duì)于胃癌的治療效果具有重要的積極作用，但我國(guó)大多數(shù)發(fā)現(xiàn)的胃癌已經(jīng)處于進(jìn)展期或晚期[21]。因此，積極尋找診斷和治療胃癌的潛在靶點(diǎn)，對(duì)于早期干預(yù)胃癌和改善胃癌患者的預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。

高通量測(cè)序和基因芯片等技術(shù)的發(fā)展使得大數(shù)據(jù)的分析得到了實(shí)現(xiàn)，而且從這些大數(shù)據(jù)樣本的分析中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多有價(jià)值的腫瘤相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析三組基因芯片的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中異常高表達(dá)的基因INHBA。INHBA編碼的激活素屬于TGF-β超家族成員，是一種二聚體糖蛋白，由兩個(gè)βA亞基組成。INHBA編碼的βA亞基與α亞基形成抑制素。激活素和抑制素參與下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，并涉及多種生物學(xué)的過(guò)程，尤其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，如增殖、分化、代謝、凋亡等，也具有重要的調(diào)節(jié)功能[22-24]。目前已有多項(xiàng)研究[25-28]表明，結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤中均有激活素的過(guò)表達(dá)。而且，在食管癌中，激活素的過(guò)表達(dá)與食管鱗癌的進(jìn)展期和較差的臨床預(yù)后具有明顯相關(guān)性[23]。

我們通過(guò)GEPIA和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)分析了INHBA基因在胃癌中的臨床意義。發(fā)現(xiàn)INHBA基因的表達(dá)在胃癌中晚期呈異常高表達(dá)，與胃癌的臨床分期和T分期具有明顯的正相關(guān)性。這些結(jié)果表明INHBA基因可能參與腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。在一項(xiàng)關(guān)于食管癌的研究中，Seder等[29]研究發(fā)現(xiàn)，INHBA基因在食管癌中呈明顯高表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，INHBA編碼的激活素能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖，而通過(guò)siRNA干擾INHBA的表達(dá)或使用激活素的抑制劑卵泡抑素則能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力。這表明INHBA的確參與腫瘤生長(zhǎng)信號(hào)的調(diào)控，與我們的分析結(jié)果相一致。而在機(jī)制方面，他們發(fā)現(xiàn)INHBA高表達(dá)的原因與該基因啟動(dòng)子甲基化水平下調(diào)有關(guān)。因此，我們也分析了INHBA基因在胃癌中的甲基化水平，分析結(jié)果提示胃癌組織中INHBA啟動(dòng)子甲基化水平也是降低的。但由于正常對(duì)照樣本數(shù)量較少(只有2例)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)，INHBA基因高表達(dá)的患者生存預(yù)后較差。而且值得注意的是，INHBA的高表達(dá)對(duì)于HER2陰性胃癌患者的生存期無(wú)影響，而對(duì)于HER2陽(yáng)性的胃癌患者，INHBA高表達(dá)則能夠明顯縮短其生存期。這表明INHBA可能參與HER2介導(dǎo)的致癌信號(hào)通路中。目前胃癌治療的一線分子靶向藥物曲妥珠單抗等就是主要通過(guò)靶向HER2，阻斷下游信號(hào)通路，抑制腫瘤血管生成和提高抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等發(fā)揮抑制腫瘤的作用。但研究表明，曲妥珠單抗化療治療HER2陽(yáng)性的胃癌患者會(huì)產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致有效率不足50%[30-31]。結(jié)合我們的分析結(jié)果，曲妥珠單抗同時(shí)結(jié)合靶向INHAB基因的藥物或可能為降低耐藥性提供新的策略。

最后，我們通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析了INHBA的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)INHBA能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且INHBA的表達(dá)與TGF-β信號(hào)核心傳導(dǎo)分子SMAD2/3/4具有明顯的相關(guān)性。研究[32]表明，TGF-β信號(hào)在腫瘤進(jìn)展的早期具有抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和發(fā)揮抑癌的作用。但當(dāng)腫瘤進(jìn)展至晚期后，腫瘤細(xì)胞逃脫TGF-β信號(hào)的抑制作用，TGF-β的過(guò)度活化則具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。而且我們的分析結(jié)果顯示，INHBA基因在胃癌的晚期也呈異常高表達(dá)。這進(jìn)一步表明INHBA基因是在胃癌的晚期通過(guò)影響TGF-β信號(hào)途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)程的。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)多種腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因INHBA及可能的調(diào)控通路。這些研究結(jié)果不僅有助于加深對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，也為胃癌的診治提供了潛在的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。由于實(shí)驗(yàn)方面的證據(jù)不足，本研究具有一定的局限性。后續(xù)的研究可通過(guò)基礎(chǔ)和臨床方面進(jìn)行，以進(jìn)一步闡明INHBA基因在胃癌進(jìn)程中的作用和機(jī)制。