杜無雙， 李紅霞， 焦順昌， 郭明洲

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心消化內科醫(yī)學部，北京 100853；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心腫瘤學部

胃癌是威脅全球人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居于惡性腫瘤的第五位，是腫瘤死亡的第三大常見原因[1]。幽門螺桿菌感染、飲酒、吸煙、攝鹽量多、進食蔬菜水果量少是胃癌的高危因素[2]。從正常的胃黏膜發(fā)展到胃癌要經歷急慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生、異型增生和進展期胃癌[3]。在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，遺傳學和表觀遺傳學發(fā)生積累性改變[4-8]。本研究擬對RAI2在胃癌中的表觀遺傳學變化進行分析。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織樣本本研究納入2010年1月至2015年12月在解放軍總醫(yī)院手術切除的未經化療的胃癌標本175例，男137例，女38例，年齡18～88歲，中位年齡60歲，按照TNM分期標準進行分類[9]。該項研究經解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(20090701)。

1.2 DNA提取和甲基化特異PCR擴增使用蛋白酶K法制備胃癌組織及正常淋巴細胞DNA。甲基化特異性PCR引物序列如下：5′-TTATGTTAGGTATCGAGTAACGTTTTC-3′(M-forward)，5′-CGAAAAAAAACAACAACTCCCTCCG-3′(M-reverse)，5′-TGTTATGTTAGGTATTGAGTAATGTTTTT-3′(U-forward)，5′-CACAAAAAAAAACAATAACTCCCTCCA-3′(U-reverse)。PCR擴增條件如下：95 ℃，5 min，1 cycle；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 5 min, 1 cycle。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析，采用χ2檢驗對RAI2表達水平、RAI2甲基化水平與臨床病理情況之間的關系進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RAI2在TCGA數據庫中的mRNA表達水平及9個CpG位點的甲基化情況從TCGA數據庫中提取出372例胃癌組織的mRNA表達和K450芯片獲得的9個CpG位點的甲基化數據。如圖1所示，RAI2基因轉錄起始位點上下游9個CpG位點的甲基化均與表達呈負相關。圖2是代表性的CpG位點(cg09443073)的甲基化狀態(tài)與RAI2表達缺失/減低呈負相關(R=-0.269，P<0.0001)。

圖1 CpG位點甲基化與RAI2表達相關性Fig 1 Correlation between expression of RAI2 and CpG methylation

圖2 散點圖：372例胃癌組織中第3個位點CpG位點(cg09443073)的甲基化與RAI2的表達缺失/減低顯著相關Fig 2 Scatter plots showed the methylation status of the 3rd (cg09443073) CpG sites, which was correlated with loss or reduced RAI2 expression

2.2 RAI2在胃癌組織中的甲基化如表1和圖3所示，RAI2在胃癌中的甲基化率為44.6%(78/175)，RAI2甲基化與TNM分期(P=0.022)和淋巴結轉移(P=0.030)相關，與年齡、性別、分化程度、脈管浸潤、腫瘤浸潤深度、吸煙和飲酒無關(P均>0.05)。

表1 RAI2的甲基化與臨床病理因素的關系Tab 1 Clinical factors and RAI2 methylation in gastric cancer

注：N：正常胃黏膜，GC：胃癌組織，U：非甲基化，M：甲基化。圖3 RAI2基因在胃癌中的甲基化狀態(tài)Fig 3 Methylation status of RAI2 in gastric cancer

3 討論

中國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，全球約50%的胃癌患者來自中國，在上海、江蘇、甘肅、青海等地明顯高發(fā)[10]，過去的大量基因組測序研究并未發(fā)現(xiàn)明顯的熱點突變，表明環(huán)境因素在胃癌發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。表觀遺傳學改變與環(huán)境的關系非常密切，特別是在腫瘤癌變的早期表觀遺傳發(fā)揮著重要作用[11]。我們過去的研究[12-15]發(fā)現(xiàn)，許多基因在胃癌中頻繁發(fā)生甲基化，這些異常甲基化的基因通過影響Wnt、TGF-β、DNA損傷修復等信號通路而影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展。我們還發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復基因的甲基化是胃癌化療敏感的標志物[6]。維甲酸通路是胚胎發(fā)育和分化過程中的關鍵信號通路，我們過去在食管癌和胃癌中發(fā)現(xiàn)CRBP1和RARβ等維甲酸通路中的關鍵基因頻繁發(fā)生甲基化[16-17]。RAI2是近年來發(fā)現(xiàn)的維甲酸通路中的一個新的分子，我們曾在結腸癌中發(fā)現(xiàn)RAI2是一個抑癌基因，且頻繁發(fā)生甲基化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)RAI2在胃癌中的甲基化率為44.6%，甲基化與胃癌的TNM分期和淋巴結轉移密切相關，提示RAI2是胃癌診斷和預后的潛在標志物。