趙海清， 覃玉梅， 黃玉斌， 汪江波

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 桂林 541001

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度高、預(yù)后差、5年生存率低[1-3]。目前，肝癌的發(fā)病機(jī)制未完全闡明，臨床上也缺乏相應(yīng)的靶向治療手段。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)具有廣泛生物學(xué)作用的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促癌或抑癌作用。王紅芳等的研究表明，肝癌組織中miR-19a的表達(dá)增多、抑癌基因第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)的表達(dá)減少且miR-19a與PTEN呈負(fù)相關(guān)[4]；經(jīng)生物信息學(xué)分析，PTEN基因mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)上有miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)，以上分析提示miR-19a可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展且靶向抑癌基因PTEN是可能的miR-19a參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。為了明確miR-19a在肝癌發(fā)生中的作用及可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將在肝癌細(xì)胞株HepG2中研究miR-19a靶向PTEN調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2、人正常肝細(xì)胞株HL-7702購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑：miR-19a mimic及陰性對(duì)照(NC)mimic由上海吉瑪公司合成，表達(dá)PTEN的GV273質(zhì)粒、空白的GV273質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司合成，MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司(貨號(hào)：K300-500)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司(貨號(hào)：C1086)，兔來(lái)源PTEN的多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab170941)。

1.1.3 儀器：熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司(型號(hào)ABI7500)，顯微鏡為日本Nikon公司(型號(hào)T2R)，凝膠成像系統(tǒng)為上海天能公司(型號(hào)1600R)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、轉(zhuǎn)染：HepG2細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞均在質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化后傳代，HL-7702細(xì)胞直接用于miR-19a、PTEN表達(dá)的檢測(cè)，HepG2細(xì)胞進(jìn)行分組，方法如下：(1)NC組：轉(zhuǎn)染NC mimic；(2)miR-19a組：轉(zhuǎn)染miR-19a mimic；(3)NC質(zhì)粒組：轉(zhuǎn)染空白的GV273質(zhì)粒；(4)NC質(zhì)粒+miR-19a組：轉(zhuǎn)染空白的GV273質(zhì)粒及miR-19a mimic；(5)PTEN質(zhì)粒+miR-19a組：轉(zhuǎn)染表達(dá)PTEN的GV273質(zhì)粒及miR-19a mimic。轉(zhuǎn)染均用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000進(jìn)行，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)：HepG2細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，分組轉(zhuǎn)染后24 h，按MTS試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在酶標(biāo)儀上讀取490 nm波長(zhǎng)的吸光值OD490。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：HepG2細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中，分組轉(zhuǎn)染后24 h，按TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性染色的細(xì)胞及DAPI陽(yáng)性染色的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，而后計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 miR-19a表達(dá)檢測(cè)：HepG2細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，分組轉(zhuǎn)染后24 h，按miRNA提取試劑盒進(jìn)行操作，分離細(xì)胞中的miRNA，按miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行操作，將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒配置反應(yīng)體系，cDNA 1 μl、反應(yīng)預(yù)混液10 μl、5 μmol/L的上游引物0.6 μl、5 μmol/L的下游引物0.6 μl、去離子水7.8 μl，混勻后在熒光定量PCR儀上按照95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s的程序反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，自動(dòng)生成循環(huán)曲線及閾值，以U6為內(nèi)參，計(jì)算miR-19a的表達(dá)量。

1.2.5 PTEN表達(dá)檢測(cè)：HepG2細(xì)胞接種在12孔培養(yǎng)板中，分組轉(zhuǎn)染后24 h，按RIPA裂解液進(jìn)行操作，裂解細(xì)胞并提取蛋白，檢測(cè)蛋白含量后取30 μg蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，將蛋白樣本加入SDS-PAGE后進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至NC膜，用質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶在室溫封閉NC膜1 h，用1∶1 000稀釋的PTEN抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體在4 ℃孵育NC膜過(guò)夜。次日，用1∶2 000稀釋的二抗在室溫孵育NC膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)顯影中得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算PTEN的蛋白表達(dá)量。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：根據(jù)Targetscan預(yù)測(cè)PTEN基因mRNA 3’UTR上miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含有野生型3’UTR序列的雙熒光素酶報(bào)告基因，將miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)突變后構(gòu)建含有突變型3’UTR序列的雙熒光素酶報(bào)告基因，將熒光素酶報(bào)告基因與miR-19a mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24 h后用質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化、3000轉(zhuǎn)/min離心10 min收集細(xì)胞，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光值和海腎熒光值，以螢火蟲(chóng)熒光值/海腎熒光值計(jì)算熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞與HL-7702細(xì)胞中miR-19a、PTEN表達(dá)的比較HepG2細(xì)胞中miR-19a的表達(dá)水平高于HL-7702細(xì)胞，PTEN的表達(dá)水平低于HL-7702細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

注：與HL-7702細(xì)胞比較，*P<0.05。圖1 HepG2細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞中miR-19a、PTEN表達(dá)的比較 A：qRT-PCR檢測(cè)miR-19a表達(dá)；B～C：Western blotting檢測(cè)PTEN表達(dá)Fig 1 Comparison of miR-19a and PTEN expressions in HepG2 cells and HL-7702 cells A: detection of miR-19a expression by qRT-PCR; B-C: the expression of PTEN detected by Western blotting

2.2 miR-19a對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)miR-19a組HepG2細(xì)胞中miR-19a的表達(dá)水平高于NC組(P<0.05)(見(jiàn)圖2A)，增殖活力OD490水平高于NC組(P<0.05)(見(jiàn)圖2B)，凋亡率低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2C～2D)。

注：與NC組比較，*P<0.05。圖2 miR-19a調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞的增殖及凋亡 A：qRT-PCR檢測(cè)miR-19a表達(dá)；B：MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖；C～D：TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig 2 miR-19a regulates proliferation and apoptosis of HepG2 cells A: detection of miR-19a expression by qRT-PCR;B: cell proliferation detected by MTS; C-D: apoptosis detected by TUNEL method

2.3 miR-19a對(duì)HepG2細(xì)胞中PTEN的靶向調(diào)節(jié)miR-19a組HepG2細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平低于NC組(P<0.05)(見(jiàn)圖3A～3B)；PTEN基因mRNA 3’UTR含有miR-19a的結(jié)合靶點(diǎn)(見(jiàn)圖3C)；miR-19a組HepG2細(xì)胞中含有野生型PTEN基因mRNA 3’UTR的熒光素酶報(bào)告基因活力低于NC組(P<0.05)(見(jiàn)圖3D)，突變型PTEN基因mRNA 3’UTR的熒光素酶報(bào)告基因活力與NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3E)。

注：與NC組比較，*P<0.05。圖3 miR-19a靶向調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞中的PTEN基因 A～B：Western blotting檢測(cè)PTEN表達(dá)；C：Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)PTEN基因mRNA 3’UTR中miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)；D：含有野生型PTEN基因mRNA 3’UTR熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力；E：含有突變型PTEN基因mRNA 3’UTR熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力Fig 3 miR-19a targeted regulates PTEN gene in HepG2 cells A-B: the expression of PTEN detected by Western blotting; C: Targetscan site predicted miR-19a binding site in 3’UTR of PTEN mRNA; D: fluorescence activity of Luciferase reporter gene containing wild-type PTEN mRNA 3’UTR; E: fluorescence activity of Luciferase reporter gene containing mutant PTEN mRNA 3’UTR

2.4 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)miR-19a調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響NC質(zhì)粒+miR-19a組HepG2細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平低于NC質(zhì)粒組，PTEN質(zhì)粒+miR-19a組HepG2細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平高于NC質(zhì)粒+miR-19a組(P<0.05)(見(jiàn)圖4A～4B)；NC質(zhì)粒+miR-19a組HepG2細(xì)胞的增殖活力OD490水平高于NC質(zhì)粒組，PTEN質(zhì)粒+miR-19a組HepG2細(xì)胞增殖活力OD490水平低于NC質(zhì)粒+miR-19a組(P<0.05)(見(jiàn)圖4C)；NC質(zhì)粒+miR-19a組HepG2細(xì)胞的凋亡率低于NC質(zhì)粒組，PTEN質(zhì)粒+miR-19a組HepG2細(xì)胞的凋亡率高于NC質(zhì)粒+miR-19a組(P<0.05)(見(jiàn)圖4D～4E)。

注：與NC質(zhì)粒組比較，*P<0.05；與NC質(zhì)粒+miR-19a組比較，#P<0.05。圖4 過(guò)表達(dá)PTEN對(duì)miR-19a調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響 A～B：Western blotting檢測(cè)PTEN表達(dá)；C：MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖；D～E：TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Fig 4 Effects of overexpression of PTEN on mir-19a regulating proliferation and apoptosis of HepG2 cells A-B: the expression of PTEN detected by Western blotting; C: cell proliferation detected by MTS; D-E: apoptosis detected by TUNEL method

3 討論

miRNAs是一類(lèi)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小分子RNA，近年來(lái)miRNAs的異常表達(dá)被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。在結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中，miR-19a均呈高表達(dá)趨勢(shì)[5-7]；另有研究表明，miR-19a在肝癌組織中表達(dá)增多且與肝癌的病理特征、臨床預(yù)后均相關(guān)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)在上述臨床研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較了肝癌細(xì)胞株HepG2及正常肝細(xì)胞HL-7702中miR-19a表達(dá)的差異，結(jié)果顯示：HepG2細(xì)胞中miR-19a的表達(dá)水平明顯高于HL-7702細(xì)胞，與miR-19a在肝癌組織中表達(dá)升高的趨勢(shì)一致，提示miR-19a可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到促癌作用。

miR-19a的促癌作用已經(jīng)在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中被證實(shí)，miR-19a對(duì)癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對(duì)癌細(xì)胞的凋亡具有抑制作用[10-13]。本實(shí)驗(yàn)在肝癌細(xì)胞株HepG2中觀察了miR-19a的促癌作用，在轉(zhuǎn)染miR-19a mimic后檢測(cè)到miR-19a的表達(dá)水平明顯升高，過(guò)表達(dá)miR-19a后HepG2細(xì)胞的增殖活力增強(qiáng)，凋亡受抑制，與miR-19a在其他惡性腫瘤細(xì)胞中的促癌作用一致，表明miR-19a對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對(duì)凋亡具有抑制作用。

miRNA發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合并抑制靶基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Targetscan進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，抑癌基因PTEN的3’UTR上含有miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合國(guó)內(nèi)王紅芳等[4]研究發(fā)現(xiàn)的肝癌中PTEN表達(dá)減少且與miR-19a呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果推測(cè)，miR-19a可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中靶向PTEN基因。本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染miR-19a mimic后，PTEN的表達(dá)水平降低，含有野生型PTEN基因mRNA 3’UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力下降，說(shuō)明miR-19a能夠在肝癌細(xì)胞中靶向抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)。

PTEN基因的抑癌作用在多種惡性腫瘤中均被證實(shí)，該基因的編碼產(chǎn)物具有雙重特異性磷酸酶活性，能夠抑制PI3K/AKT/mTOR通路中的信號(hào)分子發(fā)生去磷酸化并失活，進(jìn)而抑制該信號(hào)通路激活所介導(dǎo)的促增殖、抗凋亡效應(yīng)[14-16]。在明確miR-19a調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡并靶向抑制PTEN的表達(dá)后，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PTEN受抑制在miR-19a調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡中的作用。在設(shè)計(jì)過(guò)表達(dá)PTEN的質(zhì)粒并與miR-19a mimic共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞后，miR-19a促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明PTEN基因參與肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控，過(guò)表達(dá)PTEN能夠逆轉(zhuǎn)miR-19a的調(diào)控作用，進(jìn)而也提示miR-19a對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控與靶向抑制PTEN有關(guān)。

綜上所述，miR-19a對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，對(duì)凋亡具有抑制作用，靶向PTEN是介導(dǎo)該作用的分子機(jī)制之一，未來(lái)可針對(duì)miR-19a設(shè)計(jì)抑制物并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證miR-19a抑制物治療肝癌的價(jià)值。