張 林， 侯艷紅， 李春梅， 張 靜， 雷迎峰

1.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科，北京 100091； 2.解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室

硫氧還蛋白5(TXNDC5)因是近年來新發(fā)現(xiàn)的蛋白分子，為上皮PDI家族成員，是由324個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。Clissold等于2003年首次在肝組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中確認(rèn)該蛋白分子的存在[1]，目前國內(nèi)外有關(guān)該蛋白分子的研究較少，其功能意義尚未完全明確。但最近越來越多的研究[2-3]提示，TXNDC5在宮頸癌、肺癌等多種人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能具有一定的意義。本研究組前期的胃癌癌前疾病成熟型疣狀性胃炎與周圍正常胃黏膜組織差異蛋白組學(xué)研究中證實(shí)，TXNDC5在這類癌前病變中表達(dá)顯著上升[4]。在我們的進(jìn)一步研究[5]中采用RNA干擾的方法降低TXNDC5高表達(dá)胃癌細(xì)胞株MKN45中該基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖減慢、凋亡增加、侵襲力下降，初步分析該基因在胃癌中可能具有潛在的促癌作用。目前國內(nèi)外未見類似研究報(bào)道，該蛋白質(zhì)在胃癌細(xì)胞內(nèi)的具體作用機(jī)制仍不清楚。本研究采用二維電泳分離及ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析鑒定技術(shù)從篩選分析TXNDC5胃癌細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白質(zhì)分子入手，深入分析其在胃癌中促癌作用的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料人胃癌SGC7901細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科保持傳代，用含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、Trizol購自Gibco公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogine公司，PCR產(chǎn)物膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒，RT-PCR kitprimeSTARTM HSDNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶BglⅡ、XbaⅠ和BamHⅠpGEM-T載體、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司，F(xiàn)LAG、DMSO購自Sigma公司產(chǎn)品，TXNDC5一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，鼠源二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)Sigma公司的p3xFLAG-CMV-14載體說明書進(jìn)行，按說明序列合成3xFLAG；PCR擴(kuò)增TXNDC5的CDS區(qū)，同時(shí)引入3xFLAG標(biāo)簽；用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ將TXNDC5-3xFLAG的片段及目的載體pcDNA3.1(+)雙酶切，然后T4連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增后酶切、測序獲得序列完全正確的轉(zhuǎn)化株并大量提取質(zhì)粒。

1.3 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG載體轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細(xì)胞首先采用TaKaRa公司高純度質(zhì)粒中提試劑盒提取序列完全正確的pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG載體并提取空白載體為對照使用，詳細(xì)步驟見試劑盒說明。收集對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞接種于10.0 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長至90%融合率時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用美國Invitrogen公司LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染反應(yīng)，操作按說明書進(jìn)行。設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染對照及空白對照。

1.4 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG融合蛋白表達(dá)的鑒定pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系TXNDC5-3xFLAG融合蛋白表達(dá)的鑒定方法采用對轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取總RNA和總蛋白后行RT-PCR法和Western blotting法。

1.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取及定量細(xì)胞按1∶5(質(zhì)量/體積)的比例加入裂解液，含：7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% 3-[(3-膽酞胺醛)-二乙胺丙磺酸(CHAPS)]、2% pH 4～7緩沖液、65 mmol/L二硫蘇糖醇。勻漿30 s，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對細(xì)胞勻漿處理(200 W工作4 s，間隙10 s，共3次)，冰置60 min后，離心(15 000g，20 min)，收集上清液。蛋白樣品定量采用Bradford方法，使用島津(shimadzu)UV-2550分光光度計(jì)檢測。

1.6 利用FLAG標(biāo)簽的蛋白復(fù)合體親和純化將提取的TXNDC5-FLAG載體轉(zhuǎn)染組及對照組(空白載體組、空白對照組)的細(xì)胞總蛋白均按照Sigma公司anti-FLAG M2磁珠說明書的操作步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)提純：用滅菌離心管取適量體積親和磁珠，8 000 r/min離心30 s，自然沉淀約2 min，棄上清；隨后用20倍磁珠體積的TBS溶液將上述沉積物清洗2遍，棄上清；再用0.1 mol/L甘氨酸HCl(pH 3.5)將上述磁珠洗1遍(兩者混合不超過20 min)，棄上清，并用TBS清洗3遍。

將適量的各組總蛋白質(zhì)樣品與磁珠輕輕混勻，4 ℃緩搖孵育過夜；過夜后4 ℃、8 000 r/min離心30 s，吸棄上清；4 ℃的TBS液清洗混合物4遍，吸棄上清。各組樣品中分別加入20 μl 2×上樣緩沖液(125 mmol/L Tris HCl，pH 6.8)、4% SDS、20%甘油、0.004%溴酚藍(lán)，沸水浴煮蛋白質(zhì)樣品變性3 min；5 000 r/min離心30 s，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜分析取純化后的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)洗脫、濃縮，再經(jīng)過SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色后，按照凝膠上實(shí)驗(yàn)組和對照組相對應(yīng)的條帶，將膠條平行切割對應(yīng)的條帶，置轉(zhuǎn)入Eppendorf離心管中按序進(jìn)行以下處理：去離子水沖洗；脫色；脫水；烷基化；酶切；消化；萃?。桓稍锩擕}。將干燥的樣品與基質(zhì)(α-氰基-4-羥基肉桂酸)溶液充分混合后點(diǎn)樣于不繡鋼樣品靶(scout)上，電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜儀(ESI-Q-TOF-MS)對蛋白質(zhì)的鑒定進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜的鑒定，所有測定均在正離子模式下進(jìn)行。MS/MS譜采集采用數(shù)據(jù)依賴模式(data-depended mode)，當(dāng)4個(gè)前體離子超過閾值7 counts/s(cps)時(shí)則被選為母離子進(jìn)行MS/MS分析掃描，質(zhì)譜儀用Glu-fib的串聯(lián)碎片校正，質(zhì)量誤差為±0.1 Da。霧化氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣，源溫?0 ℃，錐孔電壓為45 V，質(zhì)量掃描范圍為400～2 200 u，MCP檢測器電壓為2 700 V，當(dāng)進(jìn)行CapLC-ESI-MS/MS全自動分析時(shí)，毛細(xì)管電壓為3 000 V，分離后的肽段直接進(jìn)入離子源，對于每一個(gè)強(qiáng)度超過閾值(5 cps)的肽段均自動進(jìn)行MS/MS測定。質(zhì)譜圖采用MassLynx軟件進(jìn)行分析。利用MatrixScience公司的站點(diǎn)查詢。數(shù)據(jù)庫選擇為Swiss-prot或NCBInr數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MASCOT引擎分析。蛋白質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)采用2個(gè)和2個(gè)以上肽段匹配且得分大于0.05，或單肽段匹配且得分大于0.01。采用兩已知質(zhì)量的峰1 020.5035和2 163.0569進(jìn)行兩點(diǎn)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量校正，質(zhì)量誤差范圍50 ppm，串級圖譜母離子誤差范圍50 ppm，碎片離子0.15 Da。酶為胰蛋白酶，允許漏切位點(diǎn)為2。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG質(zhì)粒雙酶切初步鑒定結(jié)果構(gòu)建的pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后經(jīng)電泳分析檢測，具體結(jié)果見圖1，酶切成功應(yīng)為2條條帶，挑選酶切成功的質(zhì)粒株擴(kuò)增后送DNA測序獲得序列完全正確的pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG質(zhì)粒。

圖1 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG質(zhì)粒雙酶切初步鑒定結(jié)果Fig 1 Preliminary results of double digestion of pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG plasmid

2.2 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG融合蛋白表達(dá)的鑒定結(jié)果對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG的細(xì)胞提取總RNA和總蛋白后行RT-PCR法和Western blotting法檢測融合蛋白的表達(dá)，圖2中轉(zhuǎn)染組可見融合蛋白RT-PCR條帶，圖3中亦可見轉(zhuǎn)染組表達(dá)融合蛋白條帶，結(jié)果顯示，在mRNA及蛋白質(zhì)水平均有TXNDC5-FLAG融合蛋白表達(dá)。

圖2 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG融合蛋白表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果Fig 2 RT-PCR results of pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG fusion protein expression

圖3 pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG融合蛋白表達(dá)的Western blotting檢測結(jié)果Fig 3 Western blotting results of pcDNA3.1-TXNDC5-FLAG fusion protein expression

2.3 電泳凝膠分析及蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果電泳凝膠分析共檢測到15個(gè)顯著表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，12個(gè)蛋白點(diǎn)被鑒定。這些蛋白分子涉及細(xì)胞骨架分子、炎癥反應(yīng)分子、細(xì)胞能量代謝相關(guān)分子，其中也包括部分促癌及抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物(見圖4、表1)。

圖4 SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色后凝膠上實(shí)驗(yàn)組和空白對照組相對應(yīng)的條帶Fig 4 SDS-PAGE was separated, and the bands corresponding to the experimental group and the control group were stained with Kaumas brilliant blue

表1 電泳凝膠分析TXNDC5相互作用蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Tab 1 Mass spectrometric identification of TXNDC5 interacting proteins by electrophoresis gel analysis

3 討論

TXNDC5基因是上皮PDI基因家族成員之一，該基因產(chǎn)物為TXNDC5蛋白分子，亞細(xì)胞定位于線粒體，目前國內(nèi)外對于該分子的研究較少，主要功能尚未完全明確。本研究組通過前期的實(shí)驗(yàn)研究初步證實(shí)了該分子在胃癌中具有促癌作用，但具體的分子機(jī)制尚不清楚，該項(xiàng)研究中我們通過pull-down技術(shù)配合蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)初步篩選分析了TXNDC5分子在胃癌細(xì)胞中主要的相互作用蛋白分子。通過實(shí)驗(yàn)一共確定了12個(gè)TXNDC5相互作用蛋白分子，下面對于其中的主要蛋白分子進(jìn)行分析討論。

TXNIP為相互作用蛋白質(zhì)分子中較為重要的蛋白，該分子中文為硫氧還蛋白作用蛋白，具有與多種硫氧還蛋白相互作用的功能，是細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)因子[6-7]。國內(nèi)外研究提示，該蛋白分子對于細(xì)胞的凋亡、增殖，乃至腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等均有明顯的影響[8-10]，在一些腫瘤細(xì)胞中該分子表達(dá)水平降低或功能異常促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與疾病預(yù)后不良關(guān)系密切，目前被認(rèn)為可能為潛在的抑癌基因。但目前關(guān)于該分子與胃癌的關(guān)系國內(nèi)外缺乏報(bào)道，僅Kwon等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，在TXNIP基因敲除的小鼠上可出現(xiàn)胃黏膜腺體萎縮、腸上皮化生、不典型增生等胃癌前病變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這類小鼠幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃癌發(fā)生率明顯升高。這項(xiàng)研究也提示TXNIP可能為胃癌發(fā)生中的重要抑癌分子。本項(xiàng)研究結(jié)果提示TXNIP是TXNDC5分子重要的相互作用蛋白，那么我們由此推測TXNIP與TXNDC5的相互結(jié)合作用可能限制了TXNDC5的促癌作用，對其活性起到了負(fù)性調(diào)控。而TXNIP分子的缺失或基因突變導(dǎo)致功能異常將可能使得TXNDC5的促癌活性限制減弱從而促進(jìn)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

本研究發(fā)現(xiàn)的胃癌中TXNDC5相互作用蛋白諸如PRDX2與PRDX4同屬PRDX家族，這一家族已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌、惡性淋巴瘤等諸多惡性腫瘤中異常表達(dá)，以往的研究[12-13]也發(fā)現(xiàn)該家族的分子功能與細(xì)胞的抗氧化作用、凋亡作用等關(guān)系密切。PRDX家族與TXNDC5的關(guān)系也將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

本研究采用的是FLAG Pull-down耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，這種技術(shù)采用的蛋白質(zhì)標(biāo)記為一種特殊的標(biāo)記FLAG，在國內(nèi)外已有廣泛的應(yīng)用，具有更為準(zhǔn)確高效的特點(diǎn)。中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的谷歡等[14]利用FLAG Pull-down耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)成功地篩選鑒定了胃癌細(xì)胞中Raf激酶抑制蛋白的相互作用蛋白質(zhì)，為下一步研究提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。國外也有相當(dāng)數(shù)量的研究[15-17]使用該技術(shù)明確了多個(gè)目的蛋白分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)或信號傳導(dǎo)途徑，體現(xiàn)了該技術(shù)的成熟性與高效性。

本研究仍存在許多不足，由于時(shí)間及實(shí)驗(yàn)條件所限，對于發(fā)現(xiàn)的TXNDC5相互作用蛋白質(zhì)尚未能進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞及組織表達(dá)驗(yàn)證。下一步的研究中我們將逐一完成這些分子表達(dá)的驗(yàn)證工作，并通過進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)方案和深入系統(tǒng)的研究，為闡明TXNDC5在胃癌中促癌分子機(jī)制打下重要的基礎(chǔ)。