姜曉瑜 張旭志 楊倩倩 李 陽 王曉春謝國駟 趙 俊 曲克明①

(1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

針對病原微生物對產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量的威脅，水產(chǎn)行業(yè)中常采用抗菌和抑菌藥物進行防控。其中，最常用的抗菌和抑菌藥物是移植于人藥、獸藥的抗生素。由于缺乏科學(xué)的用藥指導(dǎo)，養(yǎng)殖生產(chǎn)中各種抗生素的用法與用量往往存在盲目性，因而不但成本高(藥物浪費)、效果不理想，還會對生態(tài)環(huán)境健康造成嚴重的負面影響，特別是對有益菌群的誤傷和病原菌抗藥性增加(王玉堂, 2014)。此外，人類其他的生產(chǎn)與生活活動排放的抗生素也對水環(huán)境及生物體中的微生物種群產(chǎn)生不同程度的影響，如黃偉德等(2018)研究表明，凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)攜帶的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)已經(jīng)表現(xiàn)出了多重耐藥性。因此，為了提高病害防治效益和保護生態(tài)環(huán)境健康，“精準用藥”和“適量用藥”勢在必行。為了實現(xiàn)這個目的，藥敏試驗(Antimicrobial susceptibility testing, AST)是最好的工具(楊昆明等, 2018)。

AST 是指在離體條件下測定藥物抑制或殺滅微生物能力的試驗，旨在了解微生物對各種抗生素的敏感(或耐受)程度，以指導(dǎo)臨床選用抗生素種類及確定劑量，也可用于驗證藥物質(zhì)量、研究耐藥機理及探索耐藥的起源和傳播等(van Belkum et al, 2019)。經(jīng)典的AST 全部基于測定目標抗生素對活細胞培養(yǎng)的作用效果(因此成為表現(xiàn)型AST 檢測)，如稀釋法(Wiegand et al, 2008; Elmahdi et al, 2018)、K-B 紙片法(張昭寰等, 2014; 黃偉德等, 2018)、E-test 法(Syal et al, 2017)等。應(yīng)用這些經(jīng)典的方法時，對貴重儀器的依賴性較少，費用低，結(jié)果可直接通過肉眼觀察來判斷，且大多能夠給出最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)值。但是，它們往往需要繁瑣的操作，而且周期較長(Schumacher et al, 2018)。為了提高效率，近年來基于基因分析技術(shù)進行藥物抗性測定的方法(一般稱為基因型AST 檢測)也得到了較快發(fā)展。比如，基于擴增(Schoepp et al, 2016)和測序(Boolchandani et al, 2019)技術(shù)來分析抗性基因的方法已經(jīng)得到了研究，由于免去培養(yǎng)步驟，使整個AST周期可縮短至幾個小時甚至幾十分鐘。然而，由于基因的表達強度受眾多因素影響，基因型AST 檢測結(jié)果只能得到微生物對目標抗生素存在抗性的可能性，其陽性結(jié)果依然有待采用表現(xiàn)型AST 檢測方法予以驗證(van Belkum et al, 2019)，否則不能給出MIC 值，無法直接指導(dǎo)生產(chǎn)過程中藥物的使用，而且往往費用較高。因此，目前基于培養(yǎng)模式的表現(xiàn)型AST 檢測方法依然是業(yè)界的“金標準”(Schumacher et al, 2018;Avesar et al, 2017)。特別是其中由美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)制定的標準的微量肉湯稀釋(Broth microdilution, BMD)法(Wiegand et al, 2008)更是在全球范圍內(nèi)的到了廣泛的認可。

為了提高AST的效率和準確性，除了基因分析檢測方法之外，更多的研究集中在培養(yǎng)過程的自動化開發(fā)(Schumacher et al, 2018; Zhang et al, 2019)。其中，研究成果應(yīng)用性最好的代表是可以實現(xiàn)在線監(jiān)測微生物生長動力學(xué)過程的光密度(OD值)法(Zhou et al,2018; Vourli et al, 2017; Hayden et al, 2016)和顯微鏡法(Fredborg et al, 2015)，由于有效避免了主觀誤差，二者都可以直接給出較精確的MIC值。更重要的是這些基于自動化儀器的AST方法，顯著降低了操作者的勞動強度，因而備受歡迎，其中，前者更是已有多款商品化自動儀器面世(Zhou et al, 2018; Hayden et al,2016)。然而，目前還有3個重要的問題：1)有報道認為，光密度法所得MIC值與CLSI BMD法所得結(jié)果吻合性有待進一步驗證；2)必需昂貴儀器設(shè)備，難以廣泛推廣；3)不能進行具有光學(xué)干擾物質(zhì)(如共存蛋白、納米/微米粒子、泥沙等)存在下的AST(Zhang et al,2019)。為了解決上述問題，研究團隊基于電容耦合非接觸電導(dǎo)分析創(chuàng)建了一種全新模式的AST方法——微生物生長傳感器法(Zhang et al, 2018)。

本研究以漁業(yè)環(huán)境和水產(chǎn)品領(lǐng)域都非常關(guān)注的VP (黃偉德等, 2018; 黃夢詩等, 2019; Bonnin-Jusserand et al, 2019)為模式微生物，以卡那霉素(氨基糖苷類)、四環(huán)素(四環(huán)素類)、青霉素(β-內(nèi)酰胺類)和恩諾沙星(喹諾酮類)為代表性抗生素，對比研究了微生物生長傳感器AST 法和CLSI BMD AST 法的性能特征。

1 材料與方法

1.1 生物、化學(xué)材料與主要設(shè)備

實驗所用質(zhì)控VP 菌株(ACTT17802)購于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。4 株分離VP 菌株編號分別為20150709009-1、20140829005-2、20150718005-1和20150705007-2，前二者分離自發(fā)病凡納濱對蝦的肝胰腺，后二者來自對蝦養(yǎng)殖池水。菌株分離與保存方法參照Silva 等(2018)，取對蝦組織分別放入無菌的玻璃勻漿器內(nèi)勻漿，然后，取100 μl 勻漿液均勻涂布在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖(TCBS)瓊脂平板上，或直接取200 μl 凡納濱對蝦養(yǎng)殖池水均勻涂布在TCBS 瓊脂平板上。將涂布后的平板放入30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。第2 天挑取單個藍色或藍綠色菌落，再用TCBS 平板劃線。分離3～4 次即可獲得純化的菌株，將純化菌株進行生化鑒定。使用前分離菌株保存于–80℃冰箱中。

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基和TCBS 培養(yǎng)基為青島高科海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。NaCl 等其他化學(xué)試劑皆為分析純，皆購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。卡那霉素、四環(huán)素、青霉素和恩諾沙星購自北京索萊寶科技有限公司。

細菌培養(yǎng)采用上海知楚儀器公司生產(chǎn)的ZQZY-BG型振蕩培養(yǎng)箱。細菌培養(yǎng)液光密度(OD600nm)采用TU-1901 型紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)測定。溶液pH 由PHS-3C 型pH 計(上海精科儀器有限公司產(chǎn)品)測定。為保證不受外來菌的污染，接種等實驗在10000 級潔凈無菌室內(nèi)完成。一次性無菌96 孔平底培養(yǎng)板是康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司產(chǎn)品。BMD 實驗結(jié)果采用索尼HDR-CX405高清數(shù)碼攝像機(日本)拍照。微生物生長傳感器AST實驗采用本研究團隊設(shè)計、委托澳大利亞eDAQ 電子公司加工而成的八通道微生物生長傳感器完成。外直徑為 5 mm、壁厚為 0.4 mm 的一次性檢測管為NORELL 公司美國產(chǎn)品。透氣隔菌膜為常州創(chuàng)承科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)和定量 實驗采用黃夢詩等(2019)的方法培養(yǎng)和定量VP。質(zhì)控和分離菌株從–80℃冰箱中取出后，在TCBS 固體培養(yǎng)基上斜面劃線進行活化，在培養(yǎng)箱中于30℃下培養(yǎng)24 h。挑取培養(yǎng)菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中(含3% NaCl)，35℃振蕩過夜。通過測定OD600nm值表征細菌濃度，并用平板計數(shù)法進行驗證(Zhang et al, 2018)。

1.2.2 微生物生長傳感器AST 實驗 以考察質(zhì)控菌株對卡那霉素為例，采用微生物生長傳感器進行AST 實驗的預(yù)備工作包括以下步驟：

1) 配制0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 和8.00 mg/ml的卡那霉素儲備液。

2) 將細菌培養(yǎng)液用滅菌LB 液體培養(yǎng)基稀釋至5×107CFU/ml 作為儲備液。

3) 采用上述2種儲備液和滅菌LB液體培養(yǎng)基，配制1.5 ml的VP培養(yǎng)液共7份，其中，細菌的終濃度皆為5×105CFU/ml，抗生素的終濃度分別為0 (陽性對照)、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00和80.00 μg/ml。取1.3 ml該系列培養(yǎng)液分別用無菌進樣器裝入7個檢測管中，然后采用透氣隔菌膜封口。

4) 另取1 個檢測管，裝入1.3 ml 的LB 液體培養(yǎng)基作為陰性對照。

采用微生物生長傳感器進行AST實驗的工作示意圖見圖1。檢測管在恒溫35℃(Elmahdi et al, 2018)的傳感器中生長，系統(tǒng)按照優(yōu)化過的(Zhang et al,2018)參數(shù)(激勵頻率為2 MHz，激勵電壓為16 V)，以120 s的時間間隔連續(xù)記錄檢測管中培養(yǎng)液的校準表觀電導(dǎo)率(NACV)的變化值，共20 h。系統(tǒng)將NACV對培養(yǎng)時間作圖，形成VP的S型生長曲線。當(dāng)未發(fā)現(xiàn)VP的生長時，即表明該菌被完全抑制，該濃度的抗生素就是MIC值(Elmahdi et al, 2018)。

使用相同步驟測定VP 對四環(huán)素、青霉素和恩諾沙星的敏感性，其中，四環(huán)素在培養(yǎng)液中的終濃度為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 和16.00 μg/ml；青霉素在培養(yǎng)液中的終濃度為0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 和1.28 mg/ml；恩諾沙星在培養(yǎng)液中的終濃度為31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 和1000.00 ng/ml。如非特殊說明，實驗為3 個平行；陽性對照和陰性對照用于表征細菌增殖的正常與否及培養(yǎng)體系是否被細菌污染。

圖1 微生物生長傳感器法進行AST 測定的工作示意Fig.1 Diagram of microbial growth sensor-based AST assay

1.2.3 BMD AST 實驗 BMD AST 實驗按照CLSI(2010)推薦的方法進行。在無菌96 孔板A1 中加入180 μl 待測菌液(5×105CFU/ml)，在A2～A11 共10 個孔中分別加入100 μl 同濃度待測菌液；向A1 孔中加入20 μl 濃度為6400.00 μg/ml 的卡那霉素溶液，混勻，然后從該孔中取100 μl 混合液加入A2 孔，照此操作逐次倍比稀釋抗生素濃度至A10 (棄掉A10 孔中取出的100 μl 混合液)；不含卡那霉素的A11 孔作為陽性對照，另取100 μl 無菌LB 液體培養(yǎng)基放入A12 孔作為陰性對照。如非特殊說明，實驗為3 個平行。將準備好的該96 孔板放置于培養(yǎng)箱，于35℃下溫育20 h。取出后，肉眼根據(jù)濁度判斷生長結(jié)果并拍照。使用相同方法研究VP 對四環(huán)素、青霉素和恩諾沙星的耐藥情況，其中，四環(huán)素、青霉素和恩諾沙星的最高濃度分別為128.00、1280.00 和8.00 μg/ml。

圖2 BMD 法進行AST 測定的工作示意圖Fig.2 Diagram of BMD-based AST assay

1.3 數(shù)據(jù)處理

微生物生長傳感器和BMD 實驗所獲MIC 值相同或相差 ±1 個稀釋度的視為基本一致(Essential agreement,EA)；相差±2 和±3 個稀釋度的視為微小錯誤(minor Error, mE)；相差±3 個稀釋度以上的視為重大錯誤(Major Error, ME)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控菌株ATCC 17802 藥敏實驗結(jié)果

VP 的新陳代謝作用將LB 液體培養(yǎng)基中導(dǎo)電能力較差的大分子營養(yǎng)物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為電活性較好的氨基酸、醛、酮、無機鹽等，因而使之導(dǎo)電性增強。采用電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測器在線記錄這種導(dǎo)電性能的變化，并將之對培養(yǎng)時間作圖，即可得到生長動力學(xué)曲線。液體培養(yǎng)基中存在的抗生素通過抑制細胞的增殖/生長而影響生長曲線的動力學(xué)參數(shù)(如調(diào)整時間、最大生長速率、最大生長量等)。對應(yīng)的是，生長曲線上動力學(xué)參數(shù)的變化亦可反過來指示抗生素對微生物的抑制作用效果，是為微生物生長傳感器AST 法的工作原理(Zhang et al, 2018)。如圖3 所示，當(dāng)LB 液體培養(yǎng)基中沒有抗生素存在的情況下(陽性對照)，微生物生長傳感器通過實時監(jiān)測VP 的生長而形成的S 型曲線(圖3A1、圖3B1、圖3C1 和圖3D1)。和傳統(tǒng)的OD 值曲線(Qiu et al, 2017)、接觸式電導(dǎo)曲線(Yang et al, 2005)一樣，從該S 型曲線上可以方便地得知調(diào)整期、加速期、指數(shù)期、減緩期和穩(wěn)定期等細菌生長參數(shù)。值得注意的是，該曲線的時間分辨率為120 s，顯著高于OD 值曲線(20 min)(Qiu et al, 2017)和接觸式電導(dǎo)曲線(5 min)(Yang et al, 2005)。與陽性對照對應(yīng)的陰性對照測定結(jié)果表明，即使沒有抗生素的存在，無接種VP ATCC 17802 的LB 液體培養(yǎng)基也不會發(fā)生電導(dǎo)率的變化(培養(yǎng)過程的傳感器響應(yīng)為平滑直線，見圖3A8、圖3B8、圖3C8 和圖3D8)。

當(dāng)培養(yǎng)基中有2.50 和5.00 μg/ml 卡那霉素時，抗生素抑制VP ATCC 17802 生長的能力隨著濃度的增加而增強，但只是增大調(diào)整期，幾乎不能影響最大增殖量(圖3A2 和圖3A3)。在卡那霉素濃度為10.00、20.00、40.00 和80.00 μg/ml 時，傳感器檢測結(jié)果與陰性對照結(jié)果一致(圖3A4、圖3A5、圖3A6 和圖3A7)，表明細菌的生長被完全抑制，因而，卡那霉素對VP ATCC 17802 的MIC 為10.00 μg/ml。

當(dāng)培養(yǎng)基中有0.50和1.00 μg/ml的四環(huán)素時，抗生素抑制VP ATCC 17802生長的能力隨著濃度的增加而增強，不但持續(xù)增加調(diào)整期時長，而且顯著抑制最大生長率(圖3B2和圖3B3)。在四環(huán)素濃度為2.00、4.00、8.00和16.00 μg/ml時，傳感器檢測結(jié)果與陰性對照結(jié)果一樣(圖3B4、圖3B5、圖3B6和圖3B7)，表明細菌的生長被完全抑制，因而，四環(huán)素對VP ATCC 17802的MIC為2.00 μg/ml。

當(dāng)培養(yǎng)基中有0.04、0.08、0.16 和0.32 mg/ml 青霉素時，抗生素抑制VP ATCC 17802 生長的能力隨著濃度的增加而增強，但只是增大調(diào)整期，幾乎不影響最大增殖量(圖3C2、圖3C3、圖3C4 和圖3C5)。在青霉素濃度為0.64 mg/ml 時，傳感器檢測結(jié)果表明，20 h 內(nèi)雖未形成S 型曲線，然而具有細菌生長現(xiàn)象(圖3C6)。在青霉素濃度為1.28 mg/ml 時，傳感器檢測結(jié)果與陰性對照結(jié)果一樣(圖3C7)，表明細菌的生長被完全抑制，因而，卡那霉素對VP ATCC 17802的MIC 為1.28 mg/ml。

圖3 微生物生長傳感器法測定質(zhì)控菌株ATCC 17802 對卡那霉素(A)、四環(huán)素(B)、青霉素(C)和恩諾沙星(D)的敏感性Fig.3 Antibiotic susceptibility testing of VP against kanamycin (A), tetracycline (B), penicillin V (C)and enrofloxacin (D) with the microbial growth sensor

當(dāng)培養(yǎng)基中有31.25和62.50 ng/ml恩諾沙星時，抗生素抑制VP ATCC 17802生長的能力隨濃度的增加而增強，但只是增大調(diào)整期，幾乎不影響最大增殖量(圖3D2和圖3D3)。在卡那霉素濃度為125.00、250.00、500.00和1000.00 ng/ml時，傳感器檢測結(jié)果與陰性對照結(jié)果相同(圖3D4、圖3D5、圖3D6和圖3D7)，表明細菌的生長被完全抑制，因而，恩諾沙星對VP ATCC 17802的MIC為125.00 ng/ml。

采用BMD 進行AST 實驗的典型結(jié)果見圖4。為了避免因培養(yǎng)時間不同造成MIC 的差異(Tang et al,2013; Tsukatani et al, 2012)，BMD AST 實驗結(jié)果判讀時間與微生物生長傳感器測定時長保持完全一致(20 h)。由圖4 可以看出，卡那霉素、四環(huán)素、青霉素和恩諾沙星對VP ATCC 17802 的MIC 分別為10.00 μg/ml、2.00 μg/ml、1.28 mg/ml 和62.50 ng/ml。BMD 法測定所得到的MIC 值是微生物生長傳感器法測定值的1/2 濃度；2 種方法測定所得其他3 種抗生素的MIC 值完全吻合。因此，這2 種AST 測定結(jié)果的EA 為100%；mE 和ME 皆為0%。

圖4 BMD 法測定質(zhì)控菌株ATCC 17802 對卡那霉素(A)、四環(huán)素(B)、青霉素(C)和恩諾沙星(D)的敏感性Fig.4 Antibiotic susceptibility testing of VP against kanamycin (A), tetracyclines (B), penicillin V (C)and enrofloxacin (D) with the BMD assay

2.2 分離VP 菌株的藥敏實驗結(jié)果

以分離自養(yǎng)殖環(huán)境的2株VP和分離自生物體中的2株VP為模式微生物，采用和上述實驗完全相同的步驟測定它們對4種抗生素的敏感性。微生物生長傳感器法測定結(jié)果表明，卡那霉素對分離VP菌株的MIC值范圍為2.50～10.00 μg/ml，基本上等同于從血液中分離的菌株(1.00～8.00 μg/ml)(Hollis et al, 1976)；四環(huán)素對分離VP菌株的MIC值范圍為1.00～32.00 μg/ml，其 中，3 株 菌(20150709009-1，20150718005-1 和20150705007-2) 的MIC 值與文獻報道基本一致(1.00～2.00 μg/ml)(Hollis et al, 1976; Lopatek et al,2015)，來自于凡納濱對蝦的20140829005-2號菌株MIC值高出一個數(shù)量級；青霉素對3個分離VP菌株的MIC值都是160.00 μg/ml，該值與Hollis等(1976)的發(fā)現(xiàn)(＞128.00 μg/ml)吻合性較好，但對環(huán)境分離菌株20150718005-1的MIC值為40.00 μg/ml；恩諾沙星對分離VP菌株的MIC值范圍為62.50～125.00 ng/ml，遠低于Roque等(2001)的報道(0.45 μg/ml)。BMD AST測定MIC值基本上與微生物生長傳感器法測定結(jié)果吻合或低1倍。但也有2個例外，對20150718005-1號分離菌株，BMD AST測定四環(huán)素的MIC值是微生物生長傳感器法測定結(jié)果的2倍；對20150705007-2號分離菌株，BMD AST測定青霉素的MIC值是微生物生長傳感器法測定結(jié)果的2倍。

表1 微生物生長傳感器法和BMD 法所測定VP 分離菌株對卡那霉素、四環(huán)素、青霉素和恩諾沙星的敏感性結(jié)果Tab.1 In vitro susceptibilities of VP isolates to kanamycin, tetracycline, penicillin and enrofloxacin as determined by the microbial growth sensor based AST assay and BMD assay

3 討論

細菌生長/增殖時，新陳代謝作用將培養(yǎng)基中導(dǎo)電能力較差的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(如酵母提取物、蛋白胨、糖等)轉(zhuǎn)化分解為電活性較好的小分子物質(zhì)(如氨基酸、醛、酮、無機鹽等)，因而使混合液的導(dǎo)電性增強(Varshney et al, 2008)。通過采用電容耦合非接觸式電導(dǎo)檢測器在線記錄這種導(dǎo)電性能的變化即可繪制出微生物的生長曲線，進而用于研究微生物被目標抗生素抑制的程度(Zhang et al, 2018)，即微生物生長傳感器AST 法。該方法可以直接給出MIC 值，同時，還解決了上述光密度法存在的3 個問題。但迄今為止，微生物生長傳感器AST 法與作為金標準的CLSI BMD AST 法之間對比驗證尚未見報道。

每種抗生素都有其抗菌范圍和抗菌活性，而且，相應(yīng)范圍和活性還會隨著時空的變化而改變，比如菌群抗藥性的產(chǎn)生將對治療和預(yù)防效果產(chǎn)生巨大影響(黃偉德等, 2018; van Belkum et al, 2019)。因此，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工、生態(tài)環(huán)境保護等各個領(lǐng)域都急需正確的用藥指導(dǎo)，從而合理選用抗生素、提高療效、防止抗生素的濫用和誤用(Avesar et al, 2017; van Belkum et al, 2019)。由于正確的用藥指導(dǎo)必需建立在準確的AST數(shù)據(jù)之上，因此，近年來AST相關(guān)方法和技術(shù)得到了廣泛的研究。其中，基于液體培養(yǎng)的方法常常能比對應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)法更快地給出檢測結(jié)果，因而獲得越來越多的探討與應(yīng)用(Avesar et al, 2017)。本世紀以來，絕大多數(shù)自動、半自動藥敏實驗技術(shù)(如OD值法、流式細胞儀法等)的發(fā)展基本上都基于液體培養(yǎng)法(Zhang et al, 2019)。本研究團隊為解決現(xiàn)有基于光學(xué)和電化學(xué)原理的自動化技術(shù)存在的問題，構(gòu)建了一種微生物生長傳感器AST 方法(Zhang et al,2018)。將該方法與標準BMD AST方法進行比較驗證，歸納出以下特點：無論是以質(zhì)控菌株還是以分離菌株為研究對象，微生物生長傳感器AST測定結(jié)果和BMD AST測定結(jié)果的MIC值吻合性都很好，實驗沒有發(fā)現(xiàn)超出2個倍比濃度的差異數(shù)據(jù)(EA=100%)，說明微生物生長傳感器AST方法具有良好的準確性。如果不考慮由操作者造成的主觀和客觀誤差，本特點表明這種基于傳感器的自動化方法優(yōu)于通常流行的OD值自動化方法(Zhou et al, 2018)。此外，微生物生長傳感器AST測定的MIC值往往大于或者等于BMD AST測定的結(jié)果，這個現(xiàn)象與Vourli等(2017)的發(fā)現(xiàn)一致，其原因在于自動化儀器的靈敏度高于肉眼觀察。圖3C6曲線和其對應(yīng)的圖4C第2列濁度情況直白地表明了這一點。因此，無論是從原理還是實踐來講，傳感器方法的AST結(jié)論比基于肉眼判斷的結(jié)果都具有更高的可靠性。

眾所周知，培養(yǎng)時間是影響MIC 讀出值的重要影響因素(Tang et al, 2013; Tsukatani et al, 2012)。采用BMD AST 測定時，必需嚴格要求操作者在特定的時間節(jié)點判斷MIC 值。如果由于客觀的原因造成讀取的延遲將有可能獲得偏小的虛假數(shù)據(jù)，從而造成實驗的失敗。當(dāng)采用微生物生長傳感器AST 測定時，由于任何時刻微生物的生長狀態(tài)都存在永久記錄，所以可以在完成培養(yǎng)后的任何合適的時刻獲得目標時間節(jié)點處的MIC 值。因此，從用戶友好性來講，微生物生長傳感器AST 法具有明顯的優(yōu)勢。

BMD AST 能直接給出MIC 值是依據(jù)在培養(yǎng)時間終點(20 h)時觀察96 孔板上培養(yǎng)液的濁度，肉眼判斷透明視為該濃度抗生素抑制了VP 的生長，最低濃度即為MIC 值(CLSI, 2010)。然而，該終點觀察所得結(jié)果僅能提供是否抑制細菌生長這個定性信息。相對而言，微生物生長傳感器AST 測定時給出VP 生長的實時動力學(xué)曲線(圖3)，可以詳細報告不同種類、不同濃度抗生素對細菌生長每個階段的影響，從而給出更多的信息(Tang et al, 2013)。更重要的是同OD 值法一樣(Veses-Garcia et al, 2018)，基于記錄細菌生長曲線的該自動化方法提供準確、易讀的調(diào)整期時長數(shù)據(jù)。根據(jù)這個數(shù)據(jù)判定特定濃度的抗生素是否會完全抑制細菌生長，較之于終點判定可能會節(jié)約幾個甚至十幾個小時，因而具有更好的AST 測定效率。

比較而言，微生物生長傳感器 AST 法比標準BMD AST 法的操作相對簡便，出現(xiàn)失誤的幾率更低，而且更易于集成先進的輔助技術(shù)，比如目前已經(jīng)成熟的培養(yǎng)液自動分配技術(shù)(Zhou et al, 2018; Smith et al,2016)，進而實現(xiàn)全自動化——不但能夠進一步降低操作誤差，還能夠進一步降低對操作者專業(yè)技能的苛刻要求，從而更易于在眾多領(lǐng)域推廣(Veses-Garcia et al,2018; Mezger et al, 2015)。雖然，本研究采用VP 為模式微生物，對比驗證了微生物生長傳感器法和BMD 法進行AST 檢測的主要特征，但在成為標準化方法之前，微生物生長傳感器AST 法的精密度、重現(xiàn)性、再現(xiàn)性等特點需要更多的驗證。