劉峻宇 劉均輝 孔 杰 代 平 于 洋 孟憲紅羅 坤 曹寶祥 陳寶龍 高 煥 欒 生①

(1. 江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院 江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222005；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 中國科學(xué)院海洋研究所 中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)，亦稱南美白對蝦、太平洋白對蝦，是一種熱帶蝦，具有生長快、抗病力和適應(yīng)性強(qiáng)、味道鮮美等特點(diǎn)(唐揚(yáng)等, 2018;王興強(qiáng)等, 2004)。凡納濱對蝦20 世紀(jì)80 年代引入我國，90 年代解決了規(guī)?；绶N繁育關(guān)鍵技術(shù)后，養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，2018 年產(chǎn)量超過170 萬t (農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局, 2018)，已發(fā)展為我國單一產(chǎn)值最高的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一。凡納濱對蝦種業(yè)體系較為健全，我國每年的種蝦需求量超過100 萬對，苗種需求超過6000 億尾。以規(guī)?；蚁禐榛A(chǔ)的選擇育種，是當(dāng)前國內(nèi)外10 多家對蝦育種單位主要采用的技術(shù)體系，在該體系中，遺傳進(jìn)展主要取決于目標(biāo)性狀的遺傳力和選擇強(qiáng)度。研究表明，在奠基者群體已經(jīng)構(gòu)建遺傳力等參數(shù)固定的情況下，育種過程中增加家系數(shù)量、擴(kuò)大選育群體規(guī)模和提高選擇強(qiáng)度可有效增加遺傳進(jìn)展(欒生等, 2018)。

在傳統(tǒng)的選擇育種中，主要是應(yīng)用“可視嵌入性橡膠標(biāo)志”(Visible implant elastomer, VIE)標(biāo)識不同家系。但在高強(qiáng)度的選育計(jì)劃中，由于養(yǎng)殖家系數(shù)量太多，受限于可使用的顏色數(shù)量，難以同時區(qū)分超過200 個以上家系。而且對大量的個體進(jìn)行物理標(biāo)記的成本太高且耗時耗力，在養(yǎng)殖過程中容易發(fā)生物理標(biāo)記漂移脫落、人工讀取標(biāo)記錯誤等現(xiàn)象，也會導(dǎo)致個體所屬家系識別錯誤，產(chǎn)生系譜不準(zhǔn)確的問題，從而影響遺傳評估和選擇的準(zhǔn)確性。

隨著分子標(biāo)記的發(fā)展和分型成本的降低，微衛(wèi)星(Simple sequence repeat, SSR)、SNP(Single nucleotide polymorphism)等分子標(biāo)記已成為解決上述問題的有效途徑(桂建芳等, 2012)。其中，SNP 標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣泛，便于高通量、高度自動化檢測分析等優(yōu)點(diǎn)，通過研究其在生物基因組中的分布即能夠全面反映群體的遺傳及變異水平，在凡納濱對蝦(于洋等,2014; 王冉等, 2018)、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)(張洪偉等, 2010)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(Jiang et al, 2011)等物種中已開展應(yīng)用。利用分子標(biāo)記特別是SNP 標(biāo)記進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，在畜牧育種中也已得到廣泛應(yīng)用(李東等, 2011; 余國春等,2014)，但在水產(chǎn)動物中相關(guān)研究還較少。根據(jù)其他物種的研究結(jié)果推測，在蝦類高強(qiáng)度選育中，對人工選擇出來的優(yōu)質(zhì)候選個體進(jìn)行SNP 標(biāo)記分型，通過個體聚類分析及親緣關(guān)系鑒定，可有效區(qū)分候選個體的親本信息，構(gòu)建更為準(zhǔn)確的系譜。

當(dāng)前，通過DNA 和RNA 高通量測序可以獲得大量的多態(tài)性SNP 位點(diǎn)。然而，受基因組組裝質(zhì)量、樣本測序和分型算法等多種因素影響，很多位點(diǎn)可能是假陽性位點(diǎn)。因此，利用較大樣本量，對已有位點(diǎn)進(jìn)行分型驗(yàn)證，開發(fā)高質(zhì)量的多態(tài)性SNP 位點(diǎn)，是開展分子標(biāo)記輔助選擇的重要基礎(chǔ)工作。本研究利用飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)，開發(fā)了37 個源自轉(zhuǎn)錄組序列的SNP 標(biāo)記，并對22 個凡納濱對蝦家系進(jìn)行遺傳多樣性、家系聚類和親子鑒定分析，旨在探討SNP標(biāo)記在凡納濱對蝦選育中應(yīng)用的可行性，以期為分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖遺傳育種中心(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所鰲山基地)利用G1 代核心群留種個體，通過巢式交配設(shè)計(jì)和定向交尾的方法生產(chǎn)51 個家系，構(gòu)建凡納濱對蝦G2 代核心育種群體，并在–20℃溫度下保留親本肌肉組織。從開展生長和存活性狀測試的G2 代家系中選擇22 個全同胞家系(含4 個半同胞家系)，每個家系隨機(jī)取9～10 尾個體，共計(jì)218 尾個體，加上22 尾父本和20 尾母本，作為本實(shí)驗(yàn)的樣本材料。子代個體取腹部肌肉組織后，放入凍存管，–80℃保存。本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，共134 個SNP 位點(diǎn)及其序列信息。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

DNA 提取參照王偉繼(2008)的方法。DNA 的質(zhì)量和濃度使用超微量紫外分光光度計(jì)測量，保證DNA 的濃度＞50 ng/μl，吸光度比值(OD260nm/OD280nm)在 1.7～2.0 之間。采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性，檢測完畢的樣品置于–20℃冰箱中冷凍保存。

1.3 SNP 分型

隨機(jī)取24 尾家系親本個體，平均分為2 組，每12 尾個體的DNA 混在一起。根據(jù)樣品DNA 定量結(jié)果，將混合模板的DNA 濃度稀釋到50～100 ng/μl。根據(jù)序列信息，通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)上下游引物，擴(kuò)增含有該位點(diǎn)的DNA 片段，PCR 反應(yīng)體積為50 μl：0.25 μl Taq 酶(5 U/μl)，引物各2 μl (10 pmol/μl)，2 μl DNA(50 ng/μl)，4 μl Dntp(2.5 mmol/L)，5 μl 10×PCR Buffer (Mg2+plus)和34.75 μl ddH2O。程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，合適退火溫度下1 min，72℃ 1 min，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

利用直接測序法驗(yàn)證SNP 位點(diǎn)是否存在雙峰，若擴(kuò)增產(chǎn)物同時出現(xiàn)雙峰，即認(rèn)為該位點(diǎn)在群體內(nèi)存在多態(tài)性。針對存在雙峰的位點(diǎn)，通過Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design 軟件設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，利用多重PCR 設(shè)計(jì)2 個多重組合，對所有個體上機(jī)測試。最后采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)(Matrixassisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDITOF)分型檢測，此過程由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司支持完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

SNP 位點(diǎn)的期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)分析通過Cervus 3.0 (Kalinowski et al, 2010)軟件進(jìn)行。家系間的遺傳距離通過POPGENE 1.32(Yeh et al, 1999)軟件計(jì)算。基于非加權(quán)配對算數(shù)平均法，使用MEGA 7(Tamura et al, 2011)繪制22 個家系聚類圖。

目前，最簡單常用的親子鑒定方法是排除法(Jones et al, 2010)，其中，用累積排除概率(Cumulative probability of exclusion, CPE)表示排除不是真實(shí)親本的候選親本的概率(Dodds et al, 1996; Heaton et al,2002)。親緣關(guān)系鑒定運(yùn)用Cervus 3.0 (Kalinowski et al,2010)軟件通過似然對數(shù)比(log likelihood ratio, LOD)值判斷分析。

2 結(jié)果

2.1 SNP 分型

測序結(jié)果顯示，2 組混合DNA 樣品中有83 個位點(diǎn)出現(xiàn)明顯雙峰，剩余位點(diǎn)顯示單一的峰圖或測序失敗。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2 個多重組合(包含的位點(diǎn)數(shù)分別為27 個和28 個)，最終2 個組合中分別有18 和19 個SNP 位點(diǎn)在所有樣本中均能擴(kuò)增成功。最后利用飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)對每個樣品的37 個SNP 位點(diǎn)進(jìn)行SNP 分型檢測，多態(tài)性位點(diǎn)的引物信息見表1。

表1 凡納濱對蝦37 個SNP 位點(diǎn)的引物信息Tab.1 Information of 37 SNP loci primers in L. vannamei

續(xù)表1

2.2 家系遺傳多樣性分析

利用37 個SNP 標(biāo)記的分型信息對凡納濱對蝦22 個家系進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示，平均期望雜合度(He)為0.38；平均觀測雜合度(Ho)為0.34。平均多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)為0.30，屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)(表2)。

2.3 親子關(guān)系鑒定

在95%的置信水平下，凡納濱對蝦37 個SNP 位點(diǎn)的遺傳多樣性見表2，218 尾子代親子關(guān)系鑒定準(zhǔn)確率見表 3。單親性別已知的情況下，CPE 值在95.04%～99.75%之間，觀測鑒定率在40%左右；雙親性別已知情況下，CPE 值超過99.99%，觀測鑒定率為100%，實(shí)際鑒定率為77.27%。

2.4 家系遺傳距離和聚類分析

基于凡納濱對蝦22 個家系間的遺傳距離，繪制家系間的聚類分析圖，見圖1。家系F11 和F17、F8和F10 分別為兩對半同胞家系，其中，F(xiàn)11 和F17 家系間的遺傳距離最小(0.04)，最先聚在一起；F8 和F10家系間遺傳距離為0.10，未能最先聚在一起。

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

本研究基于凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了37 個多態(tài)性SNP 標(biāo)記。多態(tài)信息含量(PIC)是檢測群體DNA 變異程度的指標(biāo)之一，根據(jù)Botstein 等(1980)首先提出來的PIC 劃分規(guī)則，本研究群體中平均PIC含量為0.30，屬于中度多態(tài)性(0.25＜PIC＜0.5)。與利用 SNP 標(biāo)記獲得的凡納濱對蝦、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)群體遺傳多樣性分析結(jié)果類似(張建勇等, 2011; 吳瑩瑩等, 2013)。但研究表明，利用微衛(wèi)星分析凡納濱對蝦群體，獲得了較高的PIC值，平均值為0.51～0.58(陳錦豪等, 2019; 黃小帥等,2019; 孔張偉, 2018; 李東宇等, 2015)。究其原因，主要是因?yàn)镾NP 標(biāo)記僅有2 個等位基因，與SSR 標(biāo)記相比，其攜帶的PIC 較低(Kong et al, 2014)。

表2 凡納濱對蝦22 個家系在37 個SNP 位點(diǎn)上的遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity estimated using 37 SNP loci for 22 families in L. vannamei

表3 凡納濱對蝦218 尾子代親子關(guān)系鑒定準(zhǔn)確率Tab.3 Accuracy of parentage assignment for 218 offspring in L. vannamei (%)

凡納濱對蝦22 個家系Ho和He平均值分別為0.34和0.38，且HW 平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，有30%的位點(diǎn)極顯著偏離平衡，說明該群體經(jīng)過了多代選育，存在著雜合子缺失的現(xiàn)象。與已報(bào)道的凡納濱對蝦群體遺傳特性一致(Jimenez et al, 2004)，在中國對蝦(張?zhí)鞎r等, 2005)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)(Xu et al, 2001;Premruthai et al, 2002)育種群體的研究中也發(fā)現(xiàn)雜合子缺失。育種群體雜合子缺失將會導(dǎo)致純合子增加，提高有害等位基因純合的幾率，從而導(dǎo)致近交衰退幾率升高，降低群體對環(huán)境變化的適應(yīng)性(楊銳等,2000)。

3.2 家系聚類和親子鑒定分析

從家系聚類中可以觀察到(圖1)，兩組半同胞家系中只識別出其中1 組(F11 和F17 最先聚在一起)。另外一組半同胞家系F8 和F10 中，F(xiàn)8 與F12、F6 和F10 最先聚在一起。所以，對4 個家系(F6、F8、F10和F12)中的共39 尾個體進(jìn)行聚類(圖2)。從圖2 可以觀察到，F(xiàn)10 家系中的第4、第5 個個體聚類在F12家系中，F(xiàn)12 家系中的第10 個個體聚類在F10 家系中。F8 和F10 未能最先聚在一起，原因可能是F10家系中混入F12 家系的個體，導(dǎo)致F10 家系的平均遺傳距離增大，在聚類時未能優(yōu)先與F8 家系聚類在一起；且結(jié)合系譜觀察到，F(xiàn)8 和F12 家系的母本來源于同一祖先，2 個家系間親緣關(guān)系較近，造成優(yōu)先聚類的現(xiàn)象。

圖1 凡納濱對蝦22 個家系聚類分析Fig.1 Cluster analysis between 22 families in L. vannamei

圖2 凡納濱對蝦F6、F8、F10 和F12 家系個體聚類分析Fig.2 Cluster analysis among individuals in family F6, F8, F10 and F12 of L. vannamei

在父母本雙親性別已知的情況下，親子間的CPE為99.99%，觀測鑒定率達(dá)到100%，實(shí)際鑒定率達(dá)到77.27%。Kazuhiro 等(2010)利用29 個SNP 對日本黑牛(Bovine)群體進(jìn)行親子鑒定分析，單親已知和雙親已知的情況下，CPE 分別為96.93%和99.69%。相關(guān)研究表明，在20～32 個SNP 范圍內(nèi)，親子間累積排除率在95.6%～99.9%之間(Werner et al, 2004; Anderson et al, 2006; Heaton et al, 2002)，與本研究結(jié)果一致。Zhu 等(2017)利用6 對微衛(wèi)星標(biāo)記對斑節(jié)對蝦進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，實(shí)際鑒定率達(dá)到89%。郭立平等(2013)利用50 個高多態(tài)性的SNP 位點(diǎn)對938 頭西門塔爾牛(Bos taurus)進(jìn)行親子鑒定，最終實(shí)際鑒定率為41.04%，Sellars 等(2014)利用SSR 體系和SNP 體系對斑節(jié)對蝦家系鑒定能力進(jìn)行比較，各組鑒定結(jié)果表明，60 個SNP 標(biāo)記鑒定率在99%左右。本研究實(shí)際鑒定率相對較低，原因在于SNP 位點(diǎn)的數(shù)量少和存在雜合子缺失，無法提供充足的信息來鑒定出所有個體的真實(shí)父母本，且候選親本中存在一定程度的親緣關(guān)系，遺傳相似度較高，導(dǎo)致親緣關(guān)系的誤判；Sellars等(2014)研究表明，隨著SNP 位點(diǎn)數(shù)的提高，親緣關(guān)系鑒定的準(zhǔn)確性也會增加。劉均輝(2016)通過擬合指數(shù)曲線推測，在凡納濱對蝦群體中，至少需要110～130個隨機(jī)選取的SNP 位點(diǎn)，親子關(guān)系鑒定效力方可達(dá)到100%。

本研究結(jié)果表明，在性狀測試和系譜追蹤過程中，利用高質(zhì)量的SNP 標(biāo)記代替物理標(biāo)記識別家系是一種較為準(zhǔn)確可行的方法。同時，應(yīng)增加SNP 位點(diǎn)的數(shù)量，提高家系系譜鑒定的準(zhǔn)確性。