姜 濤 劉洪波 軒中亞 楊 健,①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 無(wú)錫 214081；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院 無(wú)錫 214081)

刀鱭(Coilia nasus)作為我國(guó)名貴魚類代表之一，其資源正面臨著岌岌可危的現(xiàn)狀，相關(guān)保護(hù)刻不容緩。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年第5號(hào)通告決定停止發(fā)放刀鱭(長(zhǎng)江刀魚)等的專項(xiàng)捕撈許可證，禁止其天然資源的生產(chǎn)性捕撈。我國(guó)刀鱭的生態(tài)型組成非常復(fù)雜，既有溯河洄游型的刀鱭，又有淡水定居型的短頜鱭(C. brachygnathus)和陸封型的湖鱭(C. nasus taihuensis)。其中，以第1類種群價(jià)值最高，亟待有效保護(hù)，而其余2類則廣泛分布于長(zhǎng)江沿江的湖泊及江段中，部分水域甚至形成了優(yōu)勢(shì)種群。值得注意的是，以上3類刀鱭種群間常會(huì)發(fā)生混棲現(xiàn)象(姜濤等, 2013; 陳婷婷等, 2016)，加之外形相似，一些研究報(bào)道(徐鋼春等,2014; 李孟孟等, 2017; Chen et al, 2017)甚至推翻了利用上頜骨長(zhǎng)短來(lái)區(qū)別刀鱭洄游與否的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)，使得準(zhǔn)確評(píng)價(jià)上述洄游型刀鱭的資源現(xiàn)狀及精確定位洄游型種群重要生境(“三場(chǎng)一通道”)的工作較難開展。因此，探尋更快捷地獲取刀鱭的洄游履歷、有效區(qū)別野生刀鱭所屬3類生態(tài)型狀況的手段已成為目前亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

隨著交叉學(xué)科的發(fā)展，耳石微化學(xué)“指紋”技術(shù)已被越來(lái)越多的研究證實(shí)為重建鱭屬魚類洄游習(xí)性、生境履歷、群體關(guān)聯(lián)性的有效方法(Yang et al,2006; Jiang et al, 2012、2016、2019; Khumbanyiwa et al, 2018)。然而需要注意的是，由于耳石位于魚類內(nèi)耳迷路內(nèi)，取樣會(huì)導(dǎo)致個(gè)體死亡，并破壞其頭部組織。尋找一個(gè)可快捷(甚至非致死)獲取、可有效替代耳石的材料進(jìn)行相關(guān)研究無(wú)疑具有十分重要的意義。由于耳石結(jié)構(gòu)的特殊性，軟骨魚類較難通過(guò)耳石來(lái)進(jìn)行微化學(xué)研究，取而代之的是利用鰭條微化學(xué)特征來(lái)進(jìn)行洄游履歷、群體組成特征等研究(Allen et al, 2009、2018; Phelps et al, 2012、2017)。與之相對(duì)應(yīng)，雖然硬骨魚類的相關(guān)研究常以耳石作為研究對(duì)象，但越來(lái)越多的報(bào)道證實(shí)，鰭條等硬組織也可用于魚類洄游生態(tài)學(xué)研究。Rude 等(2014)利用鰭條微化學(xué)特征成功鑒別了野生和人工孵化北美狗魚(Esox masquinongy)群體，同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)鰭條內(nèi)與水體中的鍶鈣比值(Sr/Ca)十分吻合且呈正相關(guān)關(guān)系，并且鰭條核心處(對(duì)應(yīng)于孵化場(chǎng))Sr/Ca 特征可保留至少7 年以上。Tzadik 等(2017a)比較了9 種魚類耳石和鰭條微化學(xué)，發(fā)現(xiàn)二者間堿土族元素(Sr、Ba 等)和過(guò)渡元素(Fe、Co 等)高度一致。由此可見，鰭條是伴隨魚體一生的硬組織之一，且與耳石同為刀鱭年齡鑒定的重要材料(袁傳宓等, 1978)，很有可能具有與耳石相似的微化學(xué)特征。

因此，本研究擬基于采自上述刀鱭、湖鱭和短頜鱭3 類生態(tài)型典型個(gè)體的胸鰭條和耳石組織，同步開展微化學(xué)“指紋“的比較研究。一方面，驗(yàn)證胸鰭條與耳石微化學(xué)特征的相似性，從而可作為后者替代材料用于研究刀鱭洄游習(xí)性和生境履歷；另一方面，為今后開展其他經(jīng)濟(jì)、珍稀魚類的研究提供更經(jīng)濟(jì)、快捷的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和前處理

分別于2018 年5、7 和9 月于長(zhǎng)江口南支、鄱陽(yáng)湖廬山市、太湖三山島水域采集刀鱭、短頜鱭和湖鱭各5 尾。標(biāo)本采集后冷凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。解剖前，量取標(biāo)本生物學(xué)信息(表1)后，摘取左側(cè)第1 胸鰭條和左矢耳石進(jìn)行微化學(xué)特征比較(表1)。

表1 樣品信息Tab.1 Sample details

耳石處理參考姜濤等(2016)的方法，統(tǒng)一選取矢狀面作為碾磨面。具體處理過(guò)程參考Liu 等(2018)的方法：首先，將耳石使用環(huán)氧樹脂包埋；然后，使用配備有金剛石砂輪的碾磨機(jī)(Discoplan-TS, 司特爾公司, 丹麥)打磨至耳石核心暴露；最后，使用配備有絨布拋光盤的拋光機(jī)(LaboPol-35, 司特爾公司, 丹麥)進(jìn)行拋光，至樣品表面無(wú)明顯劃痕。

統(tǒng)一摘取左側(cè)第1 胸鰭條，使用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋。待樹脂凝固后切取靠近基部的500 μm 薄片，并使用AB 膠將其粘貼于載薄片上，進(jìn)行打磨和拋光。待樣品表面無(wú)明顯劃痕后，對(duì)所有樣品進(jìn)行超聲清洗。樣品清洗后，于38℃烘箱內(nèi)過(guò)夜烘干。

1.2 微化學(xué)分析

使用電子探針微區(qū)分析儀(JXA-8100, 日本電子株式會(huì)社, 日本)分析胸鰭條和耳石上的鍶(Sr)、鈣(Ca)元素指紋特征。以碳酸鈣和鈦酸鍶分別作為Ca 和Sr元素分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品。耳石分析參數(shù)參考Jiang等(2017)的方法：耳石定量線分析加速電壓為15 kV，電子束電流為2×10–8A，束斑直徑為5 μm，分析間隔為10 μm；面分布分析加速電壓為15 kV，電子束電流為5×10–7A，束斑直徑為5 μm。胸鰭條分析條件參考耳石條件進(jìn)行優(yōu)化。其中，定量分析參考耳石分析條件選擇加速電壓15 kV、電子束電流2×10–8A。但考慮到胸鰭條較耳石剖面小，束斑直徑選用2 μm；面分布分析選擇加速電壓15 kV，同時(shí)，為了降低胸鰭條表面的損傷，在確保能夠檢測(cè)到樣品內(nèi)Sr元素的同時(shí)，電子束電流選擇降低到3.6×10–7A，束斑直徑選用2 μm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

為便于分析比較，按慣例，本研究所述“Sr/Ca比值”為同時(shí)檢測(cè)到的Sr 和Ca 元素含量的比值乘以1000 后的數(shù)值，即“Sr/Ca×1000”。

此外，為了更好地比較耳石定量線分析結(jié)果中不同階段Sr/Ca 特征的轉(zhuǎn)變，參考李孟孟等(2017)引入STARS 分析(Sequential t-test analysis of regime shifts)(Rodionov, 2004; Rodionov et al, 2005)。其中，Huber權(quán)重、置信度分別設(shè)置為1 和0.1。同時(shí)，使用SPSS 20.0 軟件分析不同階段Sr/Ca 是否具有顯著性差異(P＜0.05, Mann-Whitney U-test)。

2 結(jié)果

胸鰭條經(jīng)打磨后可見到類似耳石的年輪與核心結(jié)構(gòu)(圖1)。定量線分析結(jié)果顯示(圖2)，湖鱭和短頜鱭的胸鰭條和耳石Sr/Ca 都很穩(wěn)定。其胸鰭條Sr/Ca值分別為(1.38±0.52)～(2.04±0.74)和(1.40±0.32)～(1.81±0.66)，其耳石Sr/Ca值分別為(1.46±0.82)～(2.00±0.63)和(1.37±0.51)～(2.35±0.87)。而刀鱭胸鰭條和耳石則可觀察到較為明顯的3個(gè)階段，其中，胸鰭條第1階段為從核心0 μm至48～212 μm，其Sr/Ca值為(2.06±0.64)～(2.26±0.29)；第2階段為自核心48～212 μm至152～428 μm，Sr/Ca值為(3.17±0.38)～(4.20±0.85)；第3階段的邊緣處Sr/Ca值為(2.15±0.82)～(2.48±0.53)(P＜0.05)。同時(shí)，耳石對(duì)應(yīng)的3個(gè)階段分別為第1階段從核心0 μm至630～830 μm，Sr/Ca值為(1.34±0.70)～(1.80±0.91)；第2階段從630～830 μm至1420～2080 μm，Sr/Ca值為(4.01±0.98)～(5.17±1.45)；第3階段的邊緣處Sr/Ca值為(1.51±1.31)～(2.88±0.81)(表2)。

圖1 刀鱭胸鰭條剖面Fig.1 Section of pectoral fin ray of C. nasus

圖2 刀鱭、湖鱭和短頜鱭胸鰭條和耳石自核心至邊緣鍶鈣比特征Fig.2 Fluctuation of Sr/Ca ratio from the core to the edge in the sagittal plane of pectoral fin ray and otolith of C. nasus, C. nasus taihuensis and C. brachygnathus

表2 刀鱭、湖鱭、短頜鱭胸鰭條和耳石Sr/Ca 變化Tab.2 Fluctuation of Sr/Ca ratio along line transects from the core (0 μm) to the edge in the pectoral fin ray and otolith of C. nasus, C. nasus taihuensis and C. brachygnathus

圖3 顯示了刀鱭、湖鱭和短頜鱭胸鰭條和耳石上Sr 元素面分布特征，分析認(rèn)為，其與胸鰭條和耳石的Sr/Ca 特征相匹配。值得注意的是，胸鰭條和耳石Sr含量的面分布特征也可明顯區(qū)分出洄游的刀鱭個(gè)體(胸鰭條和耳石核心區(qū)為Sr 含量較低的藍(lán)色，外周為Sr 含量較高的綠色環(huán)帶，邊緣部分為藍(lán)色的環(huán)帶)和淡水陸封型/定居型的湖鱭/短頜鱭個(gè)體(胸鰭條和耳石均表現(xiàn)為較均一的Sr 含量低的藍(lán)色)。

3 討論

3.1 刀鱭胸鰭條和耳石微化學(xué)“指紋”特征比較

相較于耳石微化學(xué)“指紋”研究，胸鰭條“指紋”研究起步較晚，且以軟骨魚研究為多。由于軟骨魚類，如鱘魚(Acipenser gueldenstaedtii)，耳砂結(jié)構(gòu)的特殊性(Arai et al, 2002)，相關(guān)微化學(xué)工作多集中于胸鰭條上(Phelps et al, 2012、2017; Willmes et al, 2016; Sellheim et al, 2017; Allen et al, 2018)。與之相比，硬骨魚類相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少。Smith 等(2010)則證實(shí)了小口黑鱸(Micropterus dolomieu)胸鰭條中Sr/Ca 特征與其環(huán)境相符；Rude 等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，采自不同湖區(qū)北美狗魚(Esox masquinongy)鰭條中的Sr/Ca 與捕獲地水樣十分吻合；Tzadik 等(2017b)利用胸鰭條相關(guān)微化學(xué)“指紋”特征，成功識(shí)別了來(lái)自不同孵化場(chǎng)的伊氏石斑魚(Epinephelus itajara)群體。然而，迄今對(duì)于洄游型魚類的鰭條微化學(xué)研究尚很缺乏。

圖3 刀鱭、湖鱭和短頜鱭胸鰭條和耳石上Sr 元素面分布Fig.3 Sr concentrations in the sagittal otolith and pectoral fin ray plane of Coilia nasus,C. nasus taihuensis and C. brachygnathus

本研究結(jié)果顯示，刀鱭、湖鱭和短頜鱭個(gè)體耳石呈現(xiàn)出不同的“指紋”特征，分別為典型的洄游型、淡水定居型和陸封型個(gè)體(Yang et al, 2006; 姜濤等,2013)。單從它們的胸鰭條“指紋”特征的對(duì)比可以準(zhǔn)確反演出它們之間的洄游習(xí)性和生境履歷的差異。其中，湖鱭和短頜鱭呈現(xiàn)穩(wěn)定的低Sr/Ca 值，且與刀鱭胸鰭條第1 階段特征相吻合。這些Sr/Ca 值均反映了淡水生境履歷的特征(圖2)。此外，本研究中刀鱭胸鰭條和耳石一樣，自核心至邊緣可分為明顯的3 個(gè)階段，對(duì)應(yīng)于面分布圖上自核心至邊緣的藍(lán)色、綠色、藍(lán)色之間圖譜的變化。可見，二者均反映了該魚個(gè)體淡水孵化、半咸水棲息以及最終回到淡水生境的溯河洄游生活史3 個(gè)階段的過(guò)程。

對(duì)比胸鰭條和耳石Sr/Ca 不難發(fā)現(xiàn)，洄游個(gè)體在半咸水生境履歷中胸鰭條Sr/Ca 要略低于耳石；而淡水生境履歷中胸鰭條Sr/Ca 要略高于耳石。對(duì)于湖鱭和短頜鱭而言，其胸鰭條和耳石Sr/Ca，部分個(gè)體前者高于后者(如CET01、CET04、CB01 和CB03)，其他個(gè)體前者低于后者(如CET02、CET03、CET05，CB02、CB04 和CB05)。由此可見，刀鱭、湖鱭和短頜鱭的胸鰭條和耳石間Sr/Ca 值并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。而這可能是其元素積累的方式不同所致(Gillanders, 2001)。但這顯然不會(huì)影響胸鰭條代替耳石作為刀鱭洄游生態(tài)學(xué)研究的重要材料?？傊?，刀鱭胸鰭條和耳石的微化學(xué)“指紋”特征相匹配，均能清晰準(zhǔn)確地反映洄游/淡水定居的生境履歷。

3.2 刀鱭胸鰭條微化學(xué)“指紋”研究?jī)?yōu)勢(shì)

相對(duì)于耳石而言，胸鰭條分析顯然擁有對(duì)實(shí)驗(yàn)魚低損傷和非致死等優(yōu)勢(shì)。除此之外，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，二者在很多方面也存在不同。首先，從樣品的收集來(lái)看，魚類耳石分析常用矢耳石，但其數(shù)量?jī)H有2 個(gè)；而對(duì)魚類而言，其胸鰭條有許多(如刀鱭每側(cè)有6 根，共計(jì)12 根)。因此，就樣品收集而言，胸鰭條可采樣本要遠(yuǎn)多于耳石。其次，從樣品的前處理來(lái)看，無(wú)論是胸鰭條還是耳石，均需要進(jìn)行包埋、打磨和拋光處理。所不同的是，耳石以原基為球心，包裹生長(zhǎng)。因此，需要精確打磨到核心充分暴露，未打磨至核心或核心磨損、缺失均無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的微化學(xué)分析。因此，耳石需要逐一處理。與之相比，胸鰭條不存在這樣的問(wèn)題。從胸鰭條的發(fā)育來(lái)看，更類似于骨骼的柱狀結(jié)構(gòu)向外生長(zhǎng)(張宗鋒等, 2015)，這點(diǎn)從袁傳宓等(1978)所總結(jié)的胸鰭條輪紋模式也可以看出。因此，胸鰭條分析通常僅需打磨出靠近基部的樣品(Rude et al,2014; Tzadik et al, 2017b)至表面無(wú)明顯劃痕的平面即可。所以，胸鰭條一方面可以批量處理，另一方面在經(jīng)過(guò)損傷較大的微化學(xué)分析(如LA-ICPMS)后，其只需打磨去除被燒蝕部分便可以獲得新的、具有核心的表面，從而進(jìn)行其他分析研究。而耳石在核心部分損傷后，因沒(méi)有其他可以替代的部分，幾乎無(wú)法開展其他研究。

當(dāng)然，胸鰭條指紋研究也有其不足，如其雖然可以觀察年輪，但無(wú)法像耳石一樣觀察到非常清晰的日輪特征，從而在一定程度上限制了其在魚類洄游生態(tài)學(xué)上開展時(shí)間和空間綜合分析。圖2 顯示，經(jīng)過(guò)面分布分析后，胸鰭條表面已有裂痕，而耳石表面卻沒(méi)有明顯裂痕。究其原因，鰭條質(zhì)地和結(jié)構(gòu)更類似于魚類骨骼(Gillanders, 2001)，因此，不同于文石結(jié)構(gòu)的耳石能夠耐受更苛刻的分析電壓和電流條件。總之，刀鱭胸鰭條和耳石微化學(xué)“指紋”具有很強(qiáng)的相似性，憑借其取樣(非致死、低損傷、樣品數(shù)量多)和處理(易處理、可批量、反復(fù)處理)上的優(yōu)勢(shì)，可代替“耳石”廣泛應(yīng)用于各種洄游生態(tài)學(xué)的研究。

在今后的研究中，有必要就刀鱭胸鰭條核心多元素組成等進(jìn)行深入分析，以驗(yàn)證其是否可以與耳石一樣作為魚類群體識(shí)別的重要材料。除此之外，基于本研究刀鱭胸鰭條微化學(xué)“指紋”的結(jié)果不難看出，外界Sr/Ca 的變化會(huì)同時(shí)在胸鰭條和耳石上留下印記。因此，在進(jìn)行魚類微化學(xué)標(biāo)志放流時(shí)，除了大力開展耳石微化學(xué)天然標(biāo)記(袁威等, 2019)和人工標(biāo)記(司飛等, 2019)，更可以考慮以胸鰭條代替耳石來(lái)評(píng)價(jià)效果。一方面可顯著節(jié)約制樣時(shí)間和成本，另一方面也可避免實(shí)驗(yàn)材料收集過(guò)程造成的魚體死亡或組織嚴(yán)重受損。