高云紅 景琦琦 黃 濱 關(guān)長濤 張佳偉李文升 翟介明 賈玉東①
(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306;2. 青島國家科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071;4. 萊州明波水產(chǎn)有限公司 萊州 261400)
魚類的攝食和消化是一個復(fù)雜的動態(tài)生理過程,多種激素和消化酶參與其中,保證其有序進(jìn)行。在激素和消化酶的作用下,魚類形成各自特有的胃排空類型,一直以來,研究者都將胃排空率(Gastric evacuation rate, GER)作為評價(jià)魚類消化功能的重要指標(biāo)(余方平等, 2007)。胃排空率是指攝食后食物從胃中排出的速率(李可貴等, 2009)。自20世紀(jì)60年代起,胃排空率被廣泛應(yīng)用于魚類生理、生態(tài)學(xué)的評價(jià)。迄今為止,國內(nèi)學(xué)者已對多種養(yǎng)殖魚類的胃排空率進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并以多種數(shù)學(xué)模型擬合胃排空率,為科學(xué)制定養(yǎng)殖魚類投喂頻率提供重要參數(shù)。馮憲斌等(2012)深入分析了巖原鯉(Procypris rabaudi)幼魚胃排空率和攝食量;余方平等(2007)測定了美國紅魚(Sciaenops ocellatus)的胃排空率;郭浩宇等(2017)闡明了許氏平鲉(Sebastes schlegelii)幼魚的胃排空特征;仇登高等(2018)明確了投喂頻率對鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)胃排空率及消化酶的影響。研究表明,魚類胃排空率受自身內(nèi)在因素和諸多外在因素的共同影響,如魚類的種屬、日齡、飼養(yǎng)溫度、飼料種類、投喂頻率等(張波等, 2001)。攝食后,魚類攝食神經(jīng)中樞產(chǎn)生神經(jīng)沖動,刺激下丘腦垂體分泌促進(jìn)攝食或抑制攝食因子,加之食物攝入后對胃腸道刺激,生理性反饋調(diào)控?cái)z食因子分泌,引起血液生理指標(biāo)和消化酶活性的變化,影響魚類攝食行為發(fā)生。而攝食消化過程中,胃排空率與魚類血液生理狀態(tài)和消化酶活性變化是否具有相關(guān)性目前尚未有深入研究。因此,闡明魚類血液生理、消化酶和胃排空之間的關(guān)系,將有助于了解其食欲恢復(fù)狀況,科學(xué)制定最佳投喂方案,對魚類高效健康養(yǎng)殖和經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)控意義重大。
云龍石斑魚(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)是由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所與萊州明波水產(chǎn)有限公司選育的石斑魚新品種,其父本為鞍帶石斑魚,母本為云紋石斑魚(E. moara),云龍石斑魚兼具二者優(yōu)點(diǎn),具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高、生長速度快的特點(diǎn)(唐江等, 2018; 李振通等, 2019; 成美玲等,2018)。2016 年初全面推向市場后,獲得了極高贊譽(yù)。目前,對云龍石斑魚的研究主要集中在親本表型數(shù)量性狀分析、幼魚溫度和鹽度適應(yīng)調(diào)控機(jī)制(邢道超等,2017)、肌肉營養(yǎng)成分分析及品質(zhì)評價(jià)(王林娜等, 2018)等方面,而有關(guān)云龍石斑魚攝食投喂的研究尚未見報(bào)道。本文通過研究云石斑魚攝食后胃排空特征,比較線性模型、平方根模型和立方模型對胃排空曲線的擬合程度,構(gòu)建云龍石斑魚胃排空的最佳數(shù)學(xué)模型,查明云龍石斑魚攝食后血清中葡萄糖、皮質(zhì)醇含量和肝臟消化酶活性的變化規(guī)律,旨在優(yōu)化云龍石斑魚養(yǎng)殖投喂策略,為實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖提供有效技術(shù)支撐。
實(shí)驗(yàn)魚由萊州明波水產(chǎn)有限公司提供,共150尾,平均體重為(680.35±39.84) g,體長為(30.05±1.72) cm。實(shí)驗(yàn)前在5 m×5 m×1.5 m養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)1周(50尾/池,共3個養(yǎng)殖池),水溫為18℃~19℃,溶氧為9~10 mg/L,pH為7.8~8.2,NH3-N<0.5 mg/L。采用循環(huán)水飼養(yǎng),每天投喂2次(間隔12 h)。投喂海童系列商品配合飼料(粗蛋白≥48%,粗脂肪≥10%,粗灰分≤17.0%,Ca≤4.0%,賴氨酸≥2.5%,總磷≥1.5~3.0,含少量幾丁質(zhì)的蝦或蟹)。
實(shí)驗(yàn)開始前24 h 停止投喂,以保證其消化道徹底排空。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),用顆粒飼料進(jìn)行一次性飽食投喂,1 h 后清除殘餌。在投喂后0、3、6、9、12、15、18 和24 h,依次從每個養(yǎng)殖池中取6 尾魚,MS-222(100 mg/L)麻醉,解剖取樣。測定全長、體長和體重,尾靜脈取血,置于1.5 ml 的EP 管中,靜置15~20 min,3500 r/min 離心10 min,取上清液,保存于–20℃,用于檢測皮質(zhì)醇和葡萄糖含量。解剖取出胃、肝臟和腸組織。以濾紙吸干胃表面水分、稱重,排凈胃內(nèi)容物;用蒸餾水反復(fù)清洗胃內(nèi)壁,濾紙吸干、稱重,所得重量差值即為胃內(nèi)容物質(zhì)量(濕重)(曾令清等, 2011);肝臟和腸組織于–20℃保存,用于檢測消化酶活性。
1.3.1 血清中皮質(zhì)醇和葡萄糖含量測定 血清中葡萄糖含量采用南京建成公司試劑盒檢測,血清中的葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶的作用生成葡萄糖酸和H2O2,后者在過氧化物酶的作用下,將還原性4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計(jì)測定的物質(zhì),所用波長為505 nm,單位為mmol/L。血清中皮質(zhì)醇含量采用競爭法檢測,向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本,再加入生物素標(biāo)記的識別抗原,在37℃下孵育30 min,經(jīng)PBST 洗滌5 次后,加入親和素HRP,在37℃下孵育30 min,洗滌后加入顯色液,37℃顯色10 min,再加入終止液,在450 nm 波長下檢測,單位為ng/ml。
1.3.2 消化酶的測定 準(zhǔn)確稱重肝臟和腸組織,按重量(g)∶體積(ml)=1∶9,加入9倍體積1.2%的生理鹽水,冰水浴條件下機(jī)械勻漿,2500 r/min,離心10 min,取上清液,以生理鹽水1∶9稀釋為1%組織勻漿。肝臟和腸組織總蛋白濃度,淀粉酶、糜蛋白酶、脂肪酶比活力均采用南京建成公司試劑盒檢測,波長為562、660、580和660 nm,所用儀器為UV 2800紫外可見分光光度計(jì)。
1.3.3 胃排空率計(jì)算 胃內(nèi)容物殘余百分比計(jì)算公式為:
式中,P 表示任一取樣時(shí)間胃內(nèi)容物重量(濕重)占總攝食量的百分比,W0表示在任一取樣時(shí)間時(shí)胃內(nèi)容物的重量,W1表示實(shí)驗(yàn)魚飽食狀態(tài)下的總攝食量(謝小軍等, 1998)。
用線性、立方根和平方根3 種數(shù)學(xué)模型分別擬合云龍石斑魚胃排空率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。各數(shù)學(xué)模型公式如下:
線性模型:Y=A–Bt
立方模型:Y=At3+Bt2+Ct+D
平方根模型:Y0.5=A–Bt
式中,Y 為胃內(nèi)殘余食物的濕重;t 為進(jìn)餐后的時(shí)間;A、B、C、D 為常數(shù)。
采用SPSS 18.0 和GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。通過比較分析各擬合模型的相關(guān)系數(shù)(R2)、殘差標(biāo)準(zhǔn)差(SDR)、殘差平方和(RSS)值,確定云龍石斑魚最佳胃排空模型。
以相鄰取樣點(diǎn)胃內(nèi)容物量差值(St)的自然對數(shù)值與所對應(yīng)的間隔取樣時(shí)間(t)進(jìn)行線性回歸,其線性方程為:
式中,所得線性方程的斜率a 即為云龍石斑魚的瞬時(shí)排空率(劉麗華等, 2005)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),當(dāng)差異達(dá)到顯著水平,進(jìn)行Duncan 氏多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示,P<0.05 為差異顯著。3 種數(shù)學(xué)模型的參數(shù)A、B、C、D 均由統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合得到。
飽食投喂后,云龍石斑魚的胃內(nèi)容物百分比隨時(shí)間呈規(guī)律性變化(圖1)。投喂后,云龍石斑魚胃內(nèi)容物百分比呈逐漸下降的趨勢,3~6 h 急劇下降,由88.5%降至33.2%,差異顯著(P<0.05),0~3、6~15 h胃內(nèi)容物百分比下降速率較緩,攝食后15 h,胃內(nèi)容物基本排空,屬于典型的先慢后快再慢胃排空類型。
圖1 云龍石斑魚胃排空變化Fig.1 The changes of gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀× E. lanceolatus ♂)
利用SPSS 軟件將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合,可知線性模型、平方根模型、立方模型均可擬合本實(shí)驗(yàn)胃排空率(圖2)。從R2來看,立方模型>平方根模型>線性模型;從RSS 來看,線性模型>平方根模型>立方模型;從SDR 來看,線性模型>平方根模型>立方模型(表2)。綜合R2、RSS、SDR 結(jié)果,立方模型對云龍石斑魚胃排空率的擬合程度最佳,其公式為Y=–0.001t3+ 0.099t2–2.644t+20.677,根據(jù)公式可得,投喂后14.8 h,胃內(nèi)容物完全排空。
云龍石斑魚消化酶呈規(guī)律性變化(圖3)。飽食投喂后0~3 h,云龍石斑魚肝臟內(nèi)淀粉酶活性無顯著變化,3~6 h 呈急劇上升趨勢(P<0.05),6 h 時(shí)活性達(dá)到最高值(0.151 U/g prot),之后呈下降趨勢,至投喂后15 h 時(shí),肝臟內(nèi)淀粉酶活性恢復(fù)至初始水平,而投喂后云龍石斑魚腸道內(nèi)的淀粉酶活性無顯著變化,且肝臟內(nèi)淀粉酶活性高于腸道內(nèi)淀粉酶活性(圖3A)。肝腸內(nèi)的糜蛋白酶、脂肪酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,且均在飽食投喂后6 h 時(shí),活性達(dá)到最高(P<0.05),隨后顯著下降(圖3B、圖3C)。同時(shí),腸道內(nèi)糜蛋白酶活性顯著高于肝臟(P<0.05)。如表2 所示,云龍石斑魚瞬時(shí)胃排空率與肝腸消化酶(除腸道內(nèi)淀粉酶)均呈正相關(guān)(P<0.05),消化酶之間無顯著相關(guān)性。
表1 云龍石斑魚胃排空曲線的3 種數(shù)學(xué)模型擬合Tab.1 The fitting with 3 types of mathematical models for gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)
圖2 云龍石斑魚胃排空曲線的3 種數(shù)學(xué)模型擬合Fig.2 The fitting with 3 types of mathematical models for gastric evacuation of Yunlong grouper(E. moara ♀×E. lanceolatus ♂)
云龍石斑魚血清中皮質(zhì)醇和葡萄糖的含量均呈先升高后降低的變化趨勢(圖4)。投喂后0~3 h,云龍石斑魚血清中葡萄糖含量逐漸升高,3~6 h 急劇升高,差異性顯著(P<0.05),6 h 時(shí)葡萄糖含量達(dá)到最高(21.02 mmol/L),6~18 h 呈下降趨勢,18 h 后血清中葡萄糖含量不再變化(圖4A)。血清中皮質(zhì)醇含量同葡萄糖含量呈相似的變化趨勢,投喂后,血清中皮質(zhì)醇含量逐漸升高,3~6 h 急劇增加,差異顯著(P<0.05),6 h 時(shí),其含量達(dá)到最高(152.6 mmol/L)。6 h 后,血清中皮質(zhì)醇含量呈顯著下降趨勢,12 h 后無顯著差異(圖4B; P>0.05)。
魚類種屬多樣,攝食習(xí)性和消化道結(jié)構(gòu)存在差異,胃排空方式復(fù)雜多樣。研究表明,魚類胃排空方式主要有3 種類型:直線下降型、先快后慢型和先慢后快再慢型。胃排空類型與食物類型、飼料組成及魚類攝食偏好存在顯著相關(guān)性,以大而不易碎食物為食的魚類,胃排空方式多為直線下降型,如黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)(張波等, 2001)、美國紅魚(余方平等, 2007);以小而易碎食物為食的魚類,多呈先快后慢型,也被稱為固有的內(nèi)在排空方式,如:黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)(覃志彪等, 2011)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(孫曉峰等, 2011)。本研究中,投喂云龍石斑魚顆粒飼料中添加了幾丁質(zhì)外殼的蝦或蟹,延緩了消化酶與食物作用的時(shí)間,云龍石斑魚胃排空方式呈先慢后快再慢型。日本皇姑魚(Nibea japonica)(朱云海等,2013)、俄羅斯鱘魚(Acipenser gueldenstaedtii)(張濤等,2015)也呈現(xiàn)類似的胃排空方式。
表2 云龍石斑魚瞬時(shí)排空率與消化酶相關(guān)性分析Tab.2 Correlation between instantaneous emptying rate and digestive enzymes in Yunlong grouper(E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂)
圖3 云龍石斑魚攝食24 h 內(nèi)消化酶變化Fig.3 Changes of digestive enzymes of Yunlong grouper (E. moara ♀ × E. lanceolatus ♂) within 24 hours of feeding
圖4 云龍石斑魚攝食24 h 內(nèi)血清中葡萄糖和皮質(zhì)醇變化Fig.4 Changes of glucose and cortisol in serum of Yunlong grouper(E. moara ♀×E. lanceolatus ♂) within 24 hours after ingestion
魚類的胃排空方式復(fù)雜多樣,如何選擇并構(gòu)建合適的胃排空數(shù)學(xué)模型存在較大爭議。Jobling(1981)首次以數(shù)學(xué)模型評估了魚類胃排空率變化。隨后,各國研究者紛紛開展了以數(shù)學(xué)模型擬合胃排空率的研究,但如何選擇合適的數(shù)學(xué)模型擬合數(shù)據(jù),鑒于魚類種屬間差異,仍要根據(jù)具體情況進(jìn)行深入分析研究。目前,常見的數(shù)學(xué)擬合模型有線性模型、指數(shù)模型和平方根模型3 種(張波等, 2001)。本研究中,線性模型、平方根模型、立方模型均可擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),立方模型擬合度最佳。Ruohonen 等(1998)對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究發(fā)現(xiàn),在投喂后15 h,胃內(nèi)容物消化完全,但在其胃排空率達(dá)到80%~90%時(shí)(投喂后6 h),其食欲已經(jīng)基本恢復(fù),所以,將投喂后6 h 作為最適投喂間隔。Riche 等(2004)對尼羅羅非魚的研究同樣可以證實(shí)這一點(diǎn)。根據(jù)立方模型公式得出,云龍石斑魚在投喂后9.5 h 胃排空率達(dá)到80%,14.8 h 時(shí),胃內(nèi)容物全部排空。
消化酶依據(jù)消化對象不同分為淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶,其活性變化直接影響魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,進(jìn)而調(diào)控魚類的生長發(fā)育(Vera et al,2007)。魚類消化酶活性受魚類種屬、生理狀態(tài)、發(fā)育階段等內(nèi)在因素和水溫、鹽度、飼料等外在因素共同影響(黃瑾等, 2011)。魚類食性不同,消化道內(nèi)消化酶組成和活性存在顯著差異,肉食性魚類消化道短,食物的消化吸收主要在腸道,腸道中蛋白酶活性遠(yuǎn)高于其他組織(區(qū)又君等, 2012; 向梟, 2002; 吳水清,2014)。本研究結(jié)果顯示,攝食后云龍石斑魚肝臟和腸道內(nèi)消化酶活性均呈規(guī)律性變化,且在肝臟和腸道內(nèi)消化酶分布有所不同。肝臟中淀粉酶呈先升高后降低的變化趨勢,腸道內(nèi)淀粉酶活性無顯著變化,腸道內(nèi)糜蛋白酶活性顯著高于肝臟內(nèi)糜蛋白酶活性,脂肪酶在肝臟和腸道內(nèi)活性均呈先升高后降低的趨勢。吳婷婷等(1994)對鱖魚(Siniperca chuatsi)、青魚(Mylopharyngodon piceus)、鯉(Cyprinus carpio)、鯽(Carassius auratus)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)和鰱(Hypophthalmichthys molitrix)消化酶活性的研究中也得到了類似結(jié)果,發(fā)現(xiàn)草魚、鯉、鰱肝臟內(nèi)淀粉酶活性要高于腸道內(nèi)淀粉酶活性,但青魚和鯽肝臟內(nèi)淀粉酶活性顯著低于腸道內(nèi)淀粉酶活性。付新華等(2005)對大菱鲆(Scophalmus maximus)的研究發(fā)現(xiàn),腸是水解脂肪和淀粉的主要器官,而腸水解蛋白的能力較弱。魚類消化酶分布廣泛,種屬差異必然會造成其時(shí)空分布及表達(dá)活性不同。Santos 等(2016)也得出了相似的結(jié)論。云龍石斑魚作為肉食性魚類,其糜蛋白酶活力和脂肪酶活性顯著高于淀粉酶活性,同時(shí),胃排空速率與肝腸消化酶呈顯著正相關(guān)關(guān)系。
哺乳動物下丘腦中存在中樞葡萄糖感應(yīng)器和整合與發(fā)放食欲信號的中樞,可通過監(jiān)測機(jī)體內(nèi)葡萄糖的變化控制動物體的攝食情況(楊麗萍等, 2014)。Fuentes等(2013)發(fā)現(xiàn),魚類存在與哺乳動物類似的攝食調(diào)控機(jī)制,葡萄糖同樣對魚類的攝食有著重要的調(diào)控作用。本研究中,攝食后,云龍石斑魚血清中葡萄糖含量顯著升高,6 h 時(shí)達(dá)到峰值,且在3~12 h 時(shí),血清中葡萄糖含量持續(xù)維持在較高水平,認(rèn)為此時(shí)云龍石斑魚食欲尚未恢復(fù),不適宜投喂。李晨晨等(2018)在對黃顙魚的研究中指出,攝食后魚體血清葡萄糖濃度顯著升高,且飼喂不同飼料葡萄糖升高濃度有所不同。皮質(zhì)醇為糖皮質(zhì)激素,皮質(zhì)醇誘導(dǎo)葡萄糖水平升高,促進(jìn)脂肪積累(Kominiarek et al, 2018)。葡萄糖和皮質(zhì)醇協(xié)同作用,共同參與調(diào)節(jié)魚類攝食和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取。Milligan 等(2003)對虹鱒的研究發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇可以激活肝臟內(nèi)酶活性,促進(jìn)糖元合成。因此,攝食后4~9 h 中,血清中皮質(zhì)醇濃度顯著升高,可能主要用于葡萄糖合成,但具體代謝調(diào)控機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步研究。
綜上所述,攝食后云龍石斑魚血清內(nèi)葡萄糖和皮質(zhì)醇含量、肝臟及腸道內(nèi)消化酶活性均呈規(guī)律性變化,胃排空率呈典型的先慢后快再慢類型,其最優(yōu)擬合模型為立方模型,根據(jù)模型可知,云龍石斑魚食欲基本恢復(fù)時(shí)間為投喂后9.5 h (80%胃排空),基于以上數(shù)據(jù)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,云龍石斑魚每日飼喂2 次,每次間隔10 h 左右效果最佳。