伍建中，顏瑋韜，張雨云，周曉波，陳 嘉，張 瑱，葛 建

(1 大理大學(xué)，云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000;2 上海華匯拓醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203)

快樂(lè)鼠尾草(SalviasclareaL.)，別名歐鼠尾草，香紫蘇，為唇形科，鼠尾草屬草本植物。精油蒸餾自其葉子與花朵，帶有些甜味及茴香、樟腦的香味。在國(guó)外用來(lái)調(diào)味，防腐等[1-2]。國(guó)外學(xué)者報(bào)道快樂(lè)鼠尾草精油有效成分主要為揮發(fā)油，酚類(lèi)、酚酸及其衍生物[3]等；其藥理作用主要包括，抗氧化，抗菌和抗炎鎮(zhèn)痛等[3]，是一種重要的天然醫(yī)藥資源。但因?yàn)椴煌瑥S家工藝的差異。導(dǎo)致快樂(lè)鼠尾草精油的組成成分和藥理活性也有一定不同。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)選取國(guó)內(nèi)三種廠家快樂(lè)鼠尾草精油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)其進(jìn)行分析和峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)含量，并對(duì)三種廠家快樂(lè)鼠尾草精油進(jìn)行抑菌和抗炎活性評(píng)價(jià)，以期為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

7890A GC/5975C MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器，美國(guó)Agilent Technologies公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BSA-124S型精密分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HF160W型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學(xué)儀器有限公司；201型奧地利安圖斯2010酶標(biāo)儀，奧地利安圖斯公司。

1.2 試 藥

青鏈霉素(100×，批號(hào)：20190712)，Solarbio公司；氯霉素注射液(批號(hào)：1906318)，國(guó)藥集團(tuán)榮生制藥有限公司；克霉唑溶液(批號(hào)：E1009)，白云山何濟(jì)公制藥廠；快樂(lè)鼠尾草精油分別購(gòu)于云南大理A(批號(hào)20180605)、云南西雙版納B(批號(hào)20190411)、廣西南寧C(批號(hào)20190320)，規(guī)格均為10 mL。

脂多糖(批號(hào)：NO.320V035)，北京索萊寶科技有限公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(批號(hào)：2009115)，Gibco公司；RPMI-1640(批號(hào)：1833738)，Gibco公司；Fetal Bovine Serum(批號(hào)：1828728)，Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO，色譜級(jí)，批號(hào)：201608206)，天津市福晨化工廠公司；小鼠細(xì)胞上清腫瘤壞死因子-α(批號(hào)：M1090729-102a)，欣博盛生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：180726)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙氏瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：705K021)，北京索萊寶科技有限公司。

金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus(25923)、大腸埃希菌Escherichiacoli(25922)、白色念珠菌Candidaalbicans(10231)，由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；小鼠白血病巨噬細(xì)胞RAW264.7，F(xiàn)5(廣州，KCB200603YJ)。

2 方 法

2.1 快樂(lè)鼠尾草精油GC-MS定性分析

2.1.1 GC-MS分析樣品制備

稱取快樂(lè)鼠尾草精油適量，以甲醇配制成濃度為3 mg·mL-1的供試品溶液，使用孔徑為0.22 μm的聚醚砜針式過(guò)濾器過(guò)濾，備用。

2.1.2 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent氣相色譜柱(HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm)；色譜工作站OpenLab CDS ChemStationC.01.01；載氣為氦氣；載氣流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積0.3 μL；以分流比10:1分流進(jìn)樣；梯度升溫程序見(jiàn)表1；分析時(shí)間34 min。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～550；質(zhì)譜檢索采用NIST11.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，各組分的相對(duì)百分含量采用峰面積歸一化法計(jì)算。

表1 梯度洗脫程序

2.2 快樂(lè)鼠尾草精油抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 菌懸液的制備

取一只無(wú)菌試管，用注射器抽取4 mL 0.9%無(wú)菌生理鹽水，注入到試管中。用接種環(huán)挑取待測(cè)菌種1～2個(gè)單個(gè)菌落，制成菌懸液，與0.5麥?zhǔn)媳葷嵋罕葷?約含菌1.5×108CFU·mL-1)，整個(gè)操作在20 min內(nèi)完成。

2.2.2 陽(yáng)性藥的制備

氯霉素溶液：將氯霉素注射液2 mL 0.25 g加入8 mL生理鹽水配制成10 mL濃度為0.05 g·mL-1的母液，備用；

克霉唑溶液：將1 mL 15 mg·mL-1的克霉唑溶液加入9 mL生理鹽水配制成10 mL濃度為1.5 mg·mL-1的母液，備用。

2.2.3 牛津杯法測(cè)定抑菌活性[4]

將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后將適量的菌懸液均勻地涂在培養(yǎng)基表面。在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯。輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，在杯中加入樣品。分組如下：陽(yáng)性對(duì)照組氯霉素溶液1.563 mg·mL-1、0.781 mg·mL-1、0.391 mg·mL-1、0.195 mg·mL-1，0.098 mg·mL-1?？嗣惯蛉芤?.5 mg·mL-1、0.75 mg·mL-1、0.375 mg·mL-1、0.1 875 mg·mL-1、0.009375 mg·mL-1。陰性對(duì)照組為生理鹽水，給藥組為200 μL不同廠家的快樂(lè)鼠尾草精油。加藥后將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌置于溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，白色念珠菌置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。每組重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

2.3 快樂(lè)鼠尾草精油的抗炎實(shí)驗(yàn)[5]

將RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔于96孔板接種并分為：陰性對(duì)照組、模型組(LPS)、給藥組(LPS+不同濃度精油)，37 ℃，0.5%CO2培養(yǎng)24 h 后，除陰性對(duì)照組外，其余各組均加入LPS使其終濃度為1 μg·mL-1LPS刺激4 h，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行以下處理：陰性對(duì)照組和LPS模型對(duì)照組給予PBS緩沖溶液10 μL，給藥組分別加入三種不同品牌的快樂(lè)鼠尾草精油，使其終濃度為高劑量(30 μg·mL-1)、中劑量(15 μg··mL-1)、低劑量(7.5 μg·mL-1)，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)上清液中TNF-α的含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié) 果

3.1 快樂(lè)鼠尾草精油GC-MS成分分析結(jié)果

按照上述“2.1”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到快樂(lè)鼠尾草精油的總離子流圖，見(jiàn)圖1～圖3；質(zhì)譜檢索采用 NIST11. L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]。為扣除噪音干擾，本研究采用提取離子的方法對(duì)空白溶液與快樂(lè)鼠尾草精油供試品溶液圖譜進(jìn)行處理。設(shè)定提取離子波動(dòng)范圍±0.5u，化合物鑒定方法如上所述，如提取離子m/z 136，快樂(lè)鼠尾草精油供試品溶液圖譜如圖1所示?？鞓?lè)鼠尾草精油供試品溶液圖譜中于12.652 min處出現(xiàn)一差異峰，通過(guò)與對(duì)照品及NIST11. L數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，該化合物最終被確定為d-檸檬烯。成分鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 A快樂(lè)鼠尾草精油總離子圖

圖2 B廠家快樂(lè)鼠尾草精油總離子圖

圖3 C快樂(lè)鼠尾草精油總離子圖

表2 快樂(lè)鼠尾草精油中的主要化學(xué)成分

續(xù)表2

表3 快樂(lè)鼠尾草精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及白色念珠菌的抑菌直徑

3.2 快樂(lè)鼠尾草精油的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抑菌直徑敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)：直徑>20 mm屬于極敏；20 mm≥直徑>15 mm屬于高敏；15 mm≥直徑≥10 mm屬于中敏；直徑<10 mm屬于低敏。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，快樂(lè)鼠尾草精油對(duì)于三種受試菌種都具有一定的抑菌效果。其中A廠家快樂(lè)鼠尾草對(duì)白色鏈球菌高敏，對(duì)大腸埃希菌中敏，金黃色葡萄球菌低敏，B廠家尾草對(duì)白色鏈球菌和大腸埃希菌高敏，對(duì)金黃色葡萄球菌極敏。三種精油中C快樂(lè)鼠尾草精油品牌的抑菌效果最佳，對(duì)三種受試菌均為極敏。其抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4和表4。

A1-1500.00 μg·mL-1克霉唑；A2-750.00 μg·mL-1克霉唑；A3-375.00 μg·mL-1克霉唑；A4- 187.50 μg·mL-1克霉唑；A5-9.375 μg·mL-1克霉唑。A6， B6， C6-氯化鈉注射液(陰性對(duì)照)；A7，B7，C7-A快樂(lè)鼠尾草精油；A8，B8，C8-B快樂(lè)鼠尾草精油；A9，B9，C9- C快樂(lè)鼠尾草精油；B1，C1-1563 μg·mL-1氯霉素；B2，C2-781 μg·mL-1氯霉素；B3，C3-391 μg·mL-1氯霉素；B4，C4-195 μg·mL-1氯霉素；B5，C5-98 μg·mL-1氯霉素。

圖4 快樂(lè)鼠尾精油的抑菌效果

3.3 快樂(lè)鼠尾草精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

與空白對(duì)照組(152.28±27.2)比較，LPS模型對(duì)照組(715.46±88.62)細(xì)胞分泌TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；造模成功。與LPS模型對(duì)照組相比較，快樂(lè)鼠尾草精油各劑量(7.5 μg·mL-1、15 μg·mL-1、30 μg·mL-1)組細(xì)胞分泌TNF-α表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)并具有一定的劑量依賴趨勢(shì)。

圖5 快樂(lè)鼠尾草精油對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響

4 結(jié) 論

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果顯示，三種快樂(lè)鼠尾草精油共分析鑒定出45種揮發(fā)性成分，僅有5種為其共有。三種廠家快樂(lè)鼠尾草精油均以萜烯類(lèi)化合物為其主要成分，主要有d-檸檬烯，3-蒈烯和3-蒈烯。A廠家主要成分為d-檸檬烯(53.14%)、3-蒈烯(24.12%)，B廠家主要成分為d-檸檬烯(50.35%)、3-蒈烯(19.34%)；C廠家快樂(lè)鼠尾草精油主要成分為3-蒈烯(39.93%)、莰烯(13.07%)。三種廠家的主要揮發(fā)性成分于現(xiàn)有研究報(bào)道成分存在一定差異[9]；且C廠家和A，B廠家主要成分相差較大，這可能與各個(gè)廠家的工藝不同，檢測(cè)方法的不同有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)已鑒定的這些成分中，很多化合物具有一定抗菌、抗炎活性。如d-檸檬烯和3-蒈烯。檸檬烯[10]和3-蒈烯[11]不僅能通過(guò)破壞細(xì)胞膜來(lái)發(fā)揮抑菌作用，其中銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為10 mL/L和 20 mL/L，還可以通過(guò)調(diào)控NF-κB，IκB 和TNF-α 的表達(dá)來(lái)抑制炎癥[12]。

牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三種廠家快樂(lè)鼠尾草精油均對(duì)受試菌種均有一定的抑制效果，對(duì)白色念珠菌的抑菌效果都為高敏(抑菌圈>15 mm)。相對(duì)而言，C廠家的抑菌效果最好，對(duì)三種菌種的抑菌圈均>200 mm。對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果甚至好于濃度為1563 μg·mL陽(yáng)性藥氯霉素的抑制效果。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物活性的多肽因子，主要功能為抗病毒感染、抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞以及參與免疫調(diào)節(jié)，是參與炎性反應(yīng)及引起組織細(xì)胞損害的主要介質(zhì)[13]。本文通過(guò)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)RAW264.7驗(yàn)證模型中TNF-α的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)快樂(lè)鼠尾草的抗炎效果，結(jié)果顯示，快樂(lè)鼠尾草精油各劑量組TNF-α的表達(dá)均明顯降低(p<0.05)。提示快樂(lè)鼠尾草精油可能通過(guò)降低TNF-α的表達(dá)來(lái)起到抗炎作用。

三種快樂(lè)鼠尾草精油結(jié)構(gòu)復(fù)雜，各廠家之間成分相差較大。但均含有確切抑菌抗炎效果的3-蒈烯和d-檸檬烯。大量研究[14-16]證實(shí)了3-蒈烯和d-檸檬烯對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，銅綠假單胞菌等的抑制作用。三種快樂(lè)鼠尾草精油抑菌效果差異原因未知，可能與3-蒈烯和d-檸檬烯含量的不同有關(guān)。王卉[17]等通過(guò)綜述發(fā)現(xiàn)，植物精油在食品防腐抗菌方面的取得了良好的應(yīng)用，且植物精油更加安全可靠。因此推測(cè)未來(lái)在食品防腐領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)可能是快樂(lè)鼠尾草的研究重點(diǎn)。