馬國明 ， 尤永君 ， 牛 山 ， 馮敬敬 ， 范莉莉 ， 李春鵬 ， 張國中

(1．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2．北農(nóng)大科技股份有限公司 ， 北京 海淀 100083 ；3．天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司 ， 天津 空港 300308)

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)感染引起雞的一種急性或亞急性上呼吸道傳染病[1]。Apg感染后病雞主要以鼻、竇黏膜及眼結(jié)膜發(fā)炎，面部腫脹，噴嚏，流涕、流淚、眶下竇腫等為特征[2]。發(fā)病雞群表現(xiàn)采食量下降10%～50%，病死率可達(dá)5%～20%，能造成育成雞生產(chǎn)不良和淘汰率增加，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降10%～40%[1]，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該病由Beach于1920年首次報(bào)道[3]；De Blieck在1932年首次分離到病原體[4]。1962年，我國報(bào)道存在該病的疑似病例，1980年后，陸續(xù)有多個(gè)關(guān)于該病疑似病例的報(bào)道，馮文達(dá)最先于1987年分離到該病病原菌株[5]。1955年將該菌劃歸為禽巴氏桿菌[6]。Page采用傳統(tǒng)血凝抑制(HI)試驗(yàn)將Apg分為 A、B、C三個(gè)血清型[7]。Kume等通過硫氰酸鉀處理菌體細(xì)胞，再用超聲裂解菌體細(xì)胞進(jìn)行HI試驗(yàn)，提出一種血清學(xué)分類方法分別為A-1、A-2、A-3、A-4、B-1、C-1、C-2、C-3、C-4[8]。該病傳染性較強(qiáng)且呈世界性分布，發(fā)展中國家雞群發(fā)生該病時(shí)損失高于發(fā)達(dá)國家。在我國已有多個(gè)省市報(bào)道過傳染性鼻炎的發(fā)生，發(fā)病率可達(dá)20%～50%，雞群死亡率可達(dá)5%～20%[9]。近幾年，蛋雞、種雞傳染性鼻炎發(fā)生率明顯增多，未免疫雞群和免疫雞群均有發(fā)生，主要與現(xiàn)階段疫苗的血清亞型不對應(yīng)有關(guān)。本試驗(yàn)通過對國內(nèi)現(xiàn)階段雞傳染性鼻炎的流行現(xiàn)狀調(diào)查，了解國內(nèi)流行的主要血清型和致病特點(diǎn)，為篩選出適合國內(nèi)疫苗候選菌株提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 2017年1月—2019年12月，采自全國各地240個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場疑似IC發(fā)病雞的1 403份病雞頭樣品，樣品低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行Apg分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑TaqDNA Polymerase、T4連接酶等試劑，均購自Fermentas公司；IPTG、X-gal、Ampicillin，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰酪蛋白胨大豆瓊脂液體培養(yǎng)基(TSB)，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。PCR引物由華大基因合成。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)和菌落形態(tài)觀察 將病雞雞頭置于生物安全柜內(nèi)，用燒紅的手術(shù)刀片燒烙眶下竇外表面2次，做到表面無菌，用無菌手術(shù)刀切開眶下竇，用高壓過的棉拭子蘸取眶下竇黏液或漿液，無菌接種于TSA(含8%雞血清和1%NAD)培養(yǎng)基上，將平皿倒置放在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，長出菌苔后，經(jīng)多次單菌落劃線純培養(yǎng)后，觀察細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。

1.4 革蘭染色觀察 挑取純培養(yǎng)后的單菌落進(jìn)行革蘭染色鑒定，鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.5 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察 選取TSA平板的單個(gè)菌落在鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上橫向劃5～7條橫線，然后用接種環(huán)取表皮葡萄球菌從橫線中間劃一縱線，將劃好的平皿倒置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～40 h，觀察分離菌是否在葡萄球菌周圍出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象[1]。

1.6 過氧化氫酶試驗(yàn) 挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)：取5 mL的3%的過氧化氫于安瓿瓶中，然后用接種環(huán)由固體培養(yǎng)基取菌苔2環(huán)，加到安瓿瓶中與過氧化氫混合，有大量氣泡者即為陽性反應(yīng)，澄清透明者即為陰性。

1.7 PCR檢測 挑取疑似單菌落接種到TSB(加入8%雞血清和1%NAD)液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 160 r/min搖床培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)菌液當(dāng)作模板，參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T538—2015》的PCR方法擴(kuò)增保守性片段16S rRNA基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

1.8HMTp210基因擴(kuò)增和測序分型 參照Sakamoto等[10]的方法，對PCR檢測陽性的分離菌株進(jìn)行HMTp210基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、質(zhì)粒連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和陽性克隆鑒定后送華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果利用DNASTAR 5.0軟件進(jìn)行分析(Madison,WI53715,USA)，通過與GenBank中參考菌株的序列比對，初步了解Apg分離株的血清型。

1.9 代表菌株的血清型鑒定 根據(jù)臨床發(fā)病情況選取正常免疫后發(fā)病，且發(fā)病率較高，發(fā)病的蛋雞雞群產(chǎn)蛋率影響嚴(yán)重的副雞禽桿菌30株，包括HMTp210基因測序分型的A、B型和C型菌株各10株，利用經(jīng)典血凝(HA)和HI 試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定和驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離情況 2017—2019年共采集240個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場1 403份疑似樣品，共檢出有細(xì)菌感染養(yǎng)殖場228個(gè)，場陽性率為95.0%，其中Apg陽性場119個(gè)，場陽性率為49.6%；共檢出細(xì)菌1 250份，樣品中細(xì)菌陽性率為89.1%，Apg共檢出547份陽性，樣品Apg陽性率為39.0%，見表1。

表1 2017—2019年副雞禽桿菌PCR檢測結(jié)果Table 1 PCR detection of Avibacterium paragallinarum from 2017 to 2019

2.2 分離菌培養(yǎng)、染色和培養(yǎng)特性 從疑似樣品中分離到細(xì)菌后在TSA瓊脂(加入8%雞血清和1% NAD)平板上培養(yǎng)，呈現(xiàn)灰白色、半透明露珠樣、圓形、光滑、邊緣整齊、針尖樣大小凸起的菌落。分離株純化培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，100倍鏡檢觀察可見革蘭陰性菌，短桿或球桿狀，兩級略有濃染。多單個(gè)存在，也有短鏈排列，呈現(xiàn)長短不一的形態(tài)。在血瓊脂平皿上，分離株在金黃色葡萄球菌菌苔周圍均能形成明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。分離株純化培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離株的過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

2.3 PCR檢測 來自不同地區(qū)的1 403份病料中，有1 250份樣品能分離出細(xì)菌，經(jīng)PCR鑒定有547份在約500 bp處出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的條帶)，確定有547份副雞禽桿菌陽性，部分樣品的 PCR結(jié)果見圖1。

圖1 部分副雞禽桿菌分離菌株的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection of Avibacterium paragallinarum in selected samplesM：DNA marker； 1:陰性對照； 2～24：臨床分離菌株； 25：陽性對照M:DNA marker; 1:Negative control； 2-24:Clinical isolates; 25:Positive control

2.4 不同類別雞群Apg檢出率 對547份陽性樣品進(jìn)行品種分析，其中來自蛋雞的樣品911份，檢出Apg陽性樣本424份，占比46.5%；肉雞樣品共計(jì)492份，檢測Apg陽性123份，占比25.08%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同品種、類型的雞均有一定比例的副雞禽桿菌陽性檢出率。

2.5 不同區(qū)域雞群Apg檢出率 根據(jù)樣品統(tǒng)計(jì)結(jié)果，2017—2019年在全國17個(gè)省市地區(qū)的547份Apg陽性樣品分布不同，各省份Apg檢出率差別較大，Apg檢出率排名前5位的省份分別是河北、江蘇、山東、河南和遼寧，檢出率分別為56.1%、53.7%、52.4%、44.0%和38.1%，如表2所示。

表2 2017—2019年全國17個(gè)省市Apg檢測結(jié)果Table 2 PCR detection of Avibacterium paragallinarum in 17 provinces of China from 2017 to 2019

2.6 不同日齡雞群Apg檢出率 通過對不同日齡(按照50日齡為標(biāo)準(zhǔn)劃分)雞群的Apg陽性樣品的進(jìn)行分析，顯示雞群在各個(gè)日齡均有一定比例的陽性檢出率，其中301～350日齡時(shí)雞傳染性鼻炎檢出陽性率最高，陽性率為81.5%。為進(jìn)一步了解Apg每年的發(fā)病日齡趨勢，對不同日齡的檢測情況按照年份進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，2017—2019年不同日齡Apg檢測陽性率每年間變化不大，雞傳染性鼻炎集中發(fā)病時(shí)間在100～350日齡；2017—2019年1～50日齡送檢疑似Apg樣品數(shù)分別為52份、63份和95份，1～50日齡檢測陽性數(shù)占比分別為5.77%、9.52%和36.84%，送檢總數(shù)量和陽性率逐年提高。

2.7 不同月份雞群Apg檢出率 將2017—2019年間傳染性鼻炎檢出數(shù)量繪制成散點(diǎn)圖，由圖2可知，每年8月份雞傳染鼻炎發(fā)生率開始增加，從當(dāng)年的10月份到次年的5月份是傳染性鼻炎檢出較高的時(shí)段，從5月份開始，IC的陽性樣品檢出數(shù)量逐漸減少，8月份最低。結(jié)果表明雞傳染性鼻炎在氣溫波動(dòng)較大的季節(jié)發(fā)生概率較大。

圖2 2017—2019年間各月份Apg檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection of Avibacterium paragallinarum in different months from 2017 to 2019

2.8 Apg菌株P(guān)CR測序分型 選取119株分離株(如果同一養(yǎng)殖場分離到多個(gè)菌株，則選取1株純化菌株)進(jìn)行HMTp210基因的擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶，部分樣品擴(kuò)增結(jié)果見圖3。對獲得的基因序列在NCBI上進(jìn)行對比分析，檢測到A型菌株56株、B型菌株14株、C型菌株49株。

圖3 副雞禽桿菌的HMTp210基因的PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection of HMTp210 gene from Avibacterium paragallinarumM：DNA marker； 1～4和5～6：臨床分離菌株；-：陰性對照； +：陽性對照M:DNA marker; 1-4 and 5-6:Clinical isolates;-:Negative control; +:Positive control

2.9 Apg菌株HI試驗(yàn)分型 通過經(jīng)典的HA和HI試驗(yàn)對基因測序分型的30株副雞禽桿菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示30株副雞禽桿菌中，血清型鑒定為A型的為10株，鑒定為B型的為10株，鑒定為C型的為10株。對比結(jié)果顯示，血清學(xué)方法分型結(jié)果與PCR測序分型結(jié)果一致。

3 討論

我國養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展迅速，集約化養(yǎng)殖量快速攀升，多數(shù)地區(qū)養(yǎng)雞場較為集中，雞場飼養(yǎng)密度大，面臨嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病的感染壓力。特別是近些年，隨著減抗政策的推行、食品藥殘監(jiān)管和處罰力度增大，導(dǎo)致副雞禽桿菌的發(fā)病率升高，給規(guī)?；B(yǎng)雞場帶來很大經(jīng)濟(jì)損失。雞傳染性鼻炎的發(fā)病表現(xiàn)也呈現(xiàn)多樣化，其中地區(qū)、季節(jié)、品種和日齡均能影響IC的臨床表現(xiàn)、發(fā)病率和死亡率，同時(shí)養(yǎng)殖場抗生素的不合理使用，既干擾了病原的分離，也給血清學(xué)方法進(jìn)行診斷帶來難度。因此，調(diào)查我國不同地區(qū)、季節(jié)、品種和日齡雞群的傳染性鼻炎的流行現(xiàn)狀，對制定雞傳染性鼻炎的防控策略有重要意義。

在2017—2019年間，本實(shí)驗(yàn)室共收集來自全國17個(gè)省市地區(qū)240個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖場的1 403份臨床疑似副雞禽桿菌發(fā)病雞群的病料，經(jīng)細(xì)菌分離、染色鏡檢及PCR擴(kuò)增，共檢測到547份陽性樣品，119個(gè)養(yǎng)殖場Apg陽性，樣品總檢出率39.0%，場陽性率49.6%。結(jié)果顯示，3年間樣品陽性率分別為38.1%、45.7%和36.4%，場陽性率分別為45.9%、41.7%和56.1%。119株分離菌株的HMTp210基因測序分析得到A型菌株56株，B型菌株14株，C型菌株49株，表明A、B、C 三種血清型Apg菌株同時(shí)存在，Apg檢測陽性的養(yǎng)殖場數(shù)量連續(xù)3年均超過40.0%，不同品種和日齡的雞群均有不同程度感染Apg，近幾年，副雞禽桿菌的感染日齡提前的趨勢明顯；每年的10月份到次年的5月份Apg的檢出率較高；按照各省份地區(qū)檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，Apg陽性檢測率排名前5位的省份分別為河北、江蘇、山東、河南和遼寧，均是國內(nèi)養(yǎng)殖量多、養(yǎng)殖密度大的區(qū)域，從檢出率數(shù)據(jù)分析，國內(nèi)各養(yǎng)殖場對Apg的防控效果不佳，這說明雞傳染性鼻炎已經(jīng)成為困擾養(yǎng)雞場發(fā)展的重要疫病問題。

通過對分離菌株的HMTp210基因進(jìn)行測序分析，與GenBank中序列對比進(jìn)行Apg分型，結(jié)果表明我國國內(nèi)現(xiàn)階段存在A、B、C三種血清型的副雞禽桿菌菌株，其中以血清A型最多，C型次之，再次是B型。結(jié)果表明我國雞傳染性鼻炎感染情況復(fù)雜，推測可能與現(xiàn)用疫苗血清型以及當(dāng)前流行菌株的血清型不匹配，也和養(yǎng)殖場免疫程序不當(dāng)有關(guān)。本試驗(yàn)通過比較30株Apg菌株的血凝抑制試驗(yàn)分型鑒定與PCR測序分型結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)，利用HMTp210基因的擴(kuò)增、測序以及序列比對進(jìn)行分型，與經(jīng)典血清學(xué)分型方法有100%的相關(guān)性。為臨床疑似鼻炎樣品提供了一種快速診斷和分型的方法，為科學(xué)有效防控鼻炎提供數(shù)據(jù)支持。由于本次試驗(yàn)的菌株數(shù)量有限，測序分型方法還需要大量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

我國雞傳染性鼻炎的發(fā)病率和Apg的分離率越來越高，防控趨勢愈之復(fù)雜，這種現(xiàn)狀與多種因素都有關(guān)系，包括與我國目前臨床應(yīng)用鼻炎疫苗中的Apg菌株和大多數(shù)流行株血清型不匹配、畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的減抗和限抗政策的實(shí)施、從業(yè)人員的管理和技術(shù)水平參差不齊等。因此，在疫苗防控上，研究針對國內(nèi)流行株的疫苗顯得尤為重要，盡量選擇與地區(qū)流行菌株血清型一致的疫苗，加強(qiáng)免疫質(zhì)量監(jiān)管和效果評價(jià)。從生產(chǎn)管理角度，生產(chǎn)管理者要加強(qiáng)育雛育成期和產(chǎn)蛋高峰期的雞群管理，務(wù)必做好飼養(yǎng)管理，加強(qiáng)養(yǎng)雞場硬件的改造，以有利于改善季節(jié)交換時(shí)節(jié)的雞舍溫濕度和通風(fēng)管理控制，從而保證雞舍小氣候穩(wěn)定，防止雞群受到冷刺激，為雞群提供良好的環(huán)境。雞群飼養(yǎng)周期必須要建立生物安全體系，要有嚴(yán)格的疾病防控措施，否則損失會(huì)越來越大。