鄧云貴 ， 劉東海 ， 田宗旺 ， 魏國昊 ， 李 想 ， 王 琦 ， 王 瑾 ， 劉彥威，2 ， 劉 娜,2

(1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 ， 河北 邯鄲 056038；2. 河北工程大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 邯鄲 056038)

小腸腸球菌為人獸共患的條件致病菌。在國外，1985年首次從生長受阻的雛雞分離到。各日齡雞均可發(fā)病，主要危害2～3周齡的雛雞。臨床表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎、敗血癥、腦軟化、骨髓炎等[1]。一般分離率蛋雞為8.8%，肉雞為5.5%[2-3]，有的分離高達(dá)42%，死亡率為36%[4-5]，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大損失。在國內(nèi)，有鵝、狐貍、豬等動(dòng)物感染小腸腸球菌的報(bào)道[6-8]，還未見雞只感染的報(bào)道。由于小腸腸球菌常引起胚胎感染而導(dǎo)致死胚和病、弱雛雞，其病因往往歸咎于雞胚質(zhì)量差、孵育條件不佳等因素[5]。因此，其致病機(jī)制和流行情況易被忽視。鑒于此，本試驗(yàn)從1日齡(剛出殼)病弱雛雞肝臟中分離鑒定了小腸腸球菌，并建立快速檢測方法，以期為雞源小腸腸球菌病診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 腦心浸出液(BHI)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、D培養(yǎng)基-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、TaqPCR預(yù)混液，均購自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green I Premix Ex，購自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR儀，購自德國耶拿分析儀器股份公司。

1.2 菌株與病料來源 對照菌株[糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,Efa)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium,Efm)、鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum,EG)、禽腸球菌(Enterococcusavium,Eav)、盲腸腸球菌(Enterococcuscecorum,EC)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E-co)、鏈球菌(Streptococcus,S)、沙門菌(Salmonella,SE)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)]，均由河北工程大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。病料采自病雛雞內(nèi)臟。

1.3 方法

1.3.1 病理學(xué)觀察 對病雛進(jìn)行剖檢，觀察內(nèi)臟器官病變。取肝臟等器官組織，10%福爾馬林固定48 h進(jìn)行組織修塊，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，制成石蠟切片(5 μm),貼片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,樹膠封片。顯微鏡觀察。

1.3.2 分離株的培養(yǎng) 對病雞進(jìn)行剖檢，無菌采集肝臟等器官組織，接種于營養(yǎng)瓊脂，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。純化培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)；菌落涂片，革蘭染色，觀察其菌體形態(tài)。挑取營養(yǎng)瓊脂上單個(gè)菌落，接種膽鹽七葉苷培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基顏色變化。

1.3.3 分離株16S rDNA 基因序列測序 提取DNA：挑取單個(gè)菌落，置于盛有1 mL營養(yǎng)肉湯的EP管中，37 ℃搖床增菌8 h。得到的菌液12 000 r/min離心2 min，棄上清加入1 mL滅菌水吹吸混勻，再離心、棄上清，加35 μL滅菌水，98 ℃水浴15 min，12 000 r/min離心1 min，收集上清液置于無菌EP管作為DNA模板備用，-20 ℃保存。

以分離株基因組DNA為模板,用16S rDNA通用引物(上游引物16S F：5′-CTAHAGGGTAT CTAATCCT-3′，下游引物16S R：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：TaqPCR預(yù)混液(2×)12.5 μL,上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸55 s，72 ℃中延伸7 min，共35個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠成像，將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄基因序列進(jìn)行比對。

1.3.4 SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR檢測方法建立

1.3.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank小腸腸球菌sodA基因編碼區(qū)片段設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物H1 5′-CTTTCTGATATGGATGCTGTC-3′(95～115 bp)，下游引物 H2 5′-TAAATTCTTCCTTAAATGTTG-3′(261～281 bp)，擴(kuò)增片段的大小為187 bp。該引物和sodA基因測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.4.2 SYBR Green Ⅰ定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 小腸腸球菌經(jīng)腦心肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度為6.4×107CFU/mL，進(jìn)行10倍系列稀釋。提取各濃度梯度小腸腸球菌的基因組DNA。經(jīng)定量PCR擴(kuò)增后，以不同菌落數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用25 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaq(2×)12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 55 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)完成后，制作熔解曲線，采用系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。

1.3.4.3 敏感性試驗(yàn) 小腸腸球菌經(jīng)腦心肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度分別為6.4×107CFU/mL，進(jìn)行10倍系列稀釋。提取各濃度梯度DNA，分別進(jìn)行定量PCR和常規(guī)PCR。將常規(guī)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對比2種方法可檢測出的最大稀釋倍數(shù)，比較2種PCR方法的敏感性。

1.3.4.4 特異性試驗(yàn) 小腸腸球菌和對照菌株(糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、禽腸球菌、盲腸腸球菌、大腸桿菌、鏈球菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌)基因組DNA為模板，同時(shí)進(jìn)行定量PCR，檢驗(yàn)其特異性。

1.3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 選取2個(gè)稀釋倍數(shù)基因組DNA，每個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行4個(gè)平行，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值差異計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)(CV%)，檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 病雛雞剖檢及病理組織學(xué)觀察 病弱雛雞可見精神萎靡、閉目低頭、腹部偏大。剖檢可見肝臟呈土黃色(圖1A)，卵黃吸收不良(圖1B)。但肺臟、心臟、腎臟等器官無明顯病變。顯微鏡下觀察，可見肝臟組織充血、脂肪變性(圖2A、2B)。

圖1 病雛雞剖檢病變Fig.1 Lesions in autopsied chickA：肝臟呈土黃色; B：肝臟出血、淤血，卵黃吸收不良A: Liver was yellowish; B: Liver hemorrhage, congestion, and yolk malabsorption

圖2 病雛雞肝臟病理組織學(xué)觀察(H.E.染色,40×)Fig.2 Histopathological observation of liver from diseased chick(H.E.staining,40×)A：肝臟充血、出血; B：肝臟脂肪變性A: Liver congestion and bleeding; B: Liver steatosis

2.2 分離菌株鑒定 在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈圓形、灰白色、微隆起、表面光滑的不透明菌落(圖3)；在膽鹽七葉苷瓊脂上，培養(yǎng)基呈棕黑色(圖4)；革蘭染色為紫色，呈圓形，單在或成對存在的革蘭陽性球菌(圖5)。

圖3 營養(yǎng)瓊脂上菌落形態(tài)Fig.3 Morphology of bacterial colonies on nutrient agar

圖4 膽鹽七葉苷變色Fig.4 Discoloration of bile esculin agar

圖5 革蘭染色細(xì)菌形態(tài)(100×)Fig.5 Morphology of gram stained bacteria (100×)

16S rDNA通用引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后，經(jīng)基因測序得出堿基序列，將堿基序列于NCBI中比對，得出試驗(yàn)擴(kuò)增序列與小腸腸球菌基因的相似度為99.36%。

2.3 小腸腸球菌引物特異性檢測 特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，形成1條單帶，片段大小約為187 bp，與設(shè)計(jì)引物的預(yù)期基因片段大小相同。通過基因測序得出堿基序列，將堿基序列于NCBI中比對，得出試驗(yàn)擴(kuò)增序列與小腸腸球菌基因的相似度為99.36%。

2.4 定量PCR線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線 以小腸腸球菌6個(gè)稀釋梯度的DNA為模板，進(jìn)行定量PCR檢測。以各濃度菌落數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，可知模板DNA在6.4×101～6.4×106CFU/mL 6個(gè)濃度梯度呈良好的線性關(guān)系，回歸曲線的斜率為-3.379，截距為37.04，相關(guān)系數(shù)R2為0.995 4。熔解曲線是單一波峰，Tm值均為83.2～83.6 ℃(圖7)。

圖6 小腸腸球菌SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of SYBR Green Ⅰ quantitative fluorescence PCR for Enterococcus hirae

圖7 小腸腸球菌SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR熔解曲線Fig.7 Fusion curve of SYBR Green Ⅰ fluorescence quantitative PCR for Enterococcus hirae

2.5 定量PCR敏感性 通過系列梯度稀釋小腸腸球菌DNA模板，進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，將可檢測最小濃度進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，定量PCR方法可以檢測到6.4×101CFU/mL，常規(guī)PCR僅檢測到6.4×103CFU/mL(圖8、圖9)。

圖8 小腸腸球菌 SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR敏感性擴(kuò)增曲線Fig.8 Sensitivity amplification curve of SYBR Green Ⅰ quantitative fluorescence PCR for Enterococcus hirae

圖9 小腸腸球菌常規(guī)PCR敏感性電泳結(jié)果Fig.9 PCR sensitive electrophoresis results of Enterococcus hiraeM:DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～6：濃度依次為6.4×106、6.4×105、6.4×104、6.4×103、6.4×102 CFU/mL和6.4×101 CFU/mLM:DL-2 000 DNA marker； 1-6：Concentrations were 6.4×106,6.4×105,6.4×104,6.4×103,6.4×102 CFU/mL and 6.4×101 CFU/mL, respectively

2.6 定量PCR特異性 從圖10可知，只有小腸腸球菌出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、禽腸球菌、盲腸腸球菌、大腸桿菌、鏈球菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌均未起峰。

圖10 小腸腸球菌 SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR特異性檢測擴(kuò)增曲線Fig.10 Specific amplification curve of SYBR Green Ⅰ fluorescence quantitative PCR for Enterococcus hirae

2.7 定量PCR重復(fù)性 將小腸腸球菌DNA 10 倍梯度稀釋，挑選2個(gè)濃度用SYBR Green I熒光定量 PCR 反應(yīng)分別進(jìn)行4個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，并根據(jù)反應(yīng)后的Ct值計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)(CV%)，結(jié)果顯示同一個(gè)濃度梯度的4個(gè)重復(fù)中，擴(kuò)增曲線和熔解曲線基本一致，從表1可知，2個(gè)濃度的Ct值的變異系數(shù)分別為3.3%和2.9%。

表1 小腸腸球菌Ct值變異系數(shù)Table 1 Ct value variation coefficient of Enterococcus hirae

3 討論

John等(1985年)[9]首次報(bào)道小腸腸球菌可引起雞的生長抑制，Devriese等(1991年)[10]報(bào)道小腸腸球菌引起3～8日齡的雛雞敗血癥和腦局部軟化壞死，表現(xiàn)出以斜頸為特征的神經(jīng)癥狀。Hiroshi等(1997年)[11]在日本北海道某蛋雞場發(fā)現(xiàn)小腸腸球菌感染引起腹瀉，死亡率為3.53%。Kolbjornsen等(2011年)[12]在3周齡肉用仔雞首次發(fā)現(xiàn)小腸腸球菌可引起細(xì)菌性骨髓炎[13]。Bernardino等(2019年)[13]研究了因小腸腸球菌引起的心內(nèi)膜炎死亡的病例。小腸腸球菌為條件致病菌，主要危害幼雛，全球范圍內(nèi)流行，可引起多種疾病，導(dǎo)致多器官損傷，尤其心內(nèi)膜炎感染病例，死亡率可達(dá)36%[14]，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失。對小腸腸球菌感染，國內(nèi)只有人和鵝的病例報(bào)道[15]，尚未見雞感染的相關(guān)報(bào)道。因此，弄清雞小腸腸球菌感染情況，對本病防治至關(guān)重要。

本試驗(yàn)的分離株從剛出殼的病弱雛雞的肝臟分離獲得，經(jīng)純化培養(yǎng)后，在營養(yǎng)瓊脂上形成圓形細(xì)小菌落，在七葉苷培養(yǎng)能產(chǎn)生黑色物質(zhì)。在顯微鏡下，菌體為球形，革蘭染色陽性。16S rDNA序列分析與GenBank的小腸腸球菌sodA基因編碼區(qū)片段的相似性為99.36%，與其他菌株的同源性均低于95%。根據(jù)16S rDNA序列比對結(jié)果，結(jié)合菌落和菌體的形態(tài)，該分離株鑒定為小腸腸球菌。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，剛出殼的病弱雛雞可分離出多種病原菌，但均表現(xiàn)相似臨床癥狀和病變，即沒有典型示病癥狀和特征性病變，很難通過癥狀和病變判斷病原菌的種類，因此，要確定感染病原菌種類，還需進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

以前報(bào)道大腸桿菌、沙門菌是造成病弱雛雞主要原因，但近年來，研究結(jié)果顯示腸球菌替代大腸桿菌、沙門菌，成為病弱雛雞主要病原菌[16]。引起雛雞感染的腸球菌有多種，不同腸球菌有不同防治措施，因此，有必要弄清感染腸球菌種類。細(xì)菌分離培養(yǎng)是鑒定腸球菌種類金標(biāo)準(zhǔn)，但分離鑒定耗時(shí)長，操作繁瑣，缺乏時(shí)效性。而常規(guī)PCR檢測方法雖相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測方法更加快速、高效、特異性更好，但PCR產(chǎn)物需要經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，其過程使用的顯色劑(EB溶液)可致突變，污染較大[17]。近年來有國外研究者[18]利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)對肉雞心臟樣品中的小腸腸球菌進(jìn)行鑒定和定量檢測。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但LAMP法擴(kuò)增原理復(fù)雜，所需引物較多，引物設(shè)計(jì)要求較高，敏感性極高，反應(yīng)后開蓋極易形成氣溶膠污染造成假陽性的結(jié)果。本試驗(yàn)采用SYBR Green I定量PCR檢測方法可以檢測到6.4×101CFU/mL，常規(guī)PCR僅檢測到6.4×103CFU/mL；只有小腸腸球菌出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、禽腸球菌、盲腸腸球菌、大腸桿菌、鏈球菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌均未起峰；2個(gè)濃度，4次重復(fù)，變異系數(shù)小。本試驗(yàn)結(jié)果提示SYBR Green I定量PCR敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可以用于臨床和食品樣品小腸腸球菌的快速檢測。