馬瑩慧 ， 熊 馨 ， 李 月 ， 于美娜 ， 矯艷磊 ， 雷玉敏 ， 時念秋

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院 ， 吉林 吉林 132013)

我國中藥材資源豐富，其中很多中藥材具有提高免疫力的作用，例如長白山紅景天，別名庫頁紅景天或者高山紅景天，生長在海拔較高、氣候冷涼、無霜期較短、夏季晝夜溫差較大的山區(qū)。紅景天屬植物在全世界約有90余種，中國約有73種，東北有3種，只有長白山紅景天已作藥用。長白山紅景天具有補(bǔ)益之功效，可提高免疫力，還可用于延緩衰老、治療冠心病、心絞痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，已被列為國家級保健藥物新資源[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長白山紅景天的主要藥效成分包括紅景天甙類、黃酮類、多糖類、香豆素類等，其中多糖類成分有著降血糖、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功效[2-6]。本試驗(yàn)從長白山紅景天多糖類成分的提取著手，對提取出的粗多糖進(jìn)行純化，并對其免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行探究，為后續(xù)進(jìn)一步將長白山紅景天多糖類成分開發(fā)為保健食品提供理論依據(jù)[7-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 JA電子精密天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；98-1-C型數(shù)字控溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；UV-1800型紫外分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)。

1.1.2 藥品與試劑 長白山紅景天(購自吉林大藥房)；95%乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；乙醚(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；丙酮(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠)；無水乙醇(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；三氯甲烷(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；正丁醇(天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠)；磷酸、硫酸、苯酚(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；D-無水葡萄糖對照品(南京森貝伽生物科技有限公司)；MTT、 PBS、 DMSO、胎牛血清(美國Sigma)；Raw264.7細(xì)胞(上海細(xì)胞庫)；Mouse IL-1β ELISA Kit和Mouse TNF-α ELISA Kit(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 長白山紅景天長白山紅景天多糖的提取 采取水提醇沉法提取長白山紅景天多糖。取干燥的長白山紅景天原料適量，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，稱取5 g并加入10倍量的水煎煮1 h，抽濾后收集濾液。將分離后得到的濾渣加入8倍量的水再次進(jìn)行煎煮1 h，抽濾后合并2次所得濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮到原來體積的1/5。使用醇沉法沉淀長白山紅景天多糖濃縮液，加入95%乙醇使?jié)饪s液中乙醇濃度達(dá)到70%，密封在10℃冰箱靜置冷藏處理24 h。取出冷藏放置了24 h的樣品溶液，抽濾，得到的粗多糖沉淀順次通過無水乙醇、丙酮、乙醚溶液沖洗，并將沖洗后所得的糊狀沉淀放入38 ℃烘箱中干燥。烘干后獲得長白山紅景天粗多糖0.48 g。經(jīng)考察后使用苯酚硫酸法來測定長白山紅景天粗多糖中多糖成分的含量，使用考馬斯亮藍(lán)法測定出長白山紅景天粗多糖中的蛋白質(zhì)成分的含量。

1.2.2 長白山紅景天長白山紅景天多糖的純化 采取Sevage法來脫除長白山紅景天粗多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。設(shè)計(jì)L9(3)4正交試驗(yàn)，考察Sevage試劑體積比、料液比、離心時間、離心次數(shù)對純化長白山紅景天粗多糖的影響，以確定最優(yōu)純化方法。其中使用氯仿與正丁醇配制一定比例的Sevage試劑，與樣品按照一定比例混合于離心管中，每離心1次吸出上清液，加入新Sevage試劑并繼續(xù)離心，直到看不見沉淀為止，用移液槍吸出上清液并再次測定長白山紅景天多糖含量與蛋白質(zhì)含量，放入38 ℃烘箱中烘干備用。

1.2.3 免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)

1.2.3.1 樣品溶液的制備 稱取適量提取純化后的長白山紅景天多糖干燥樣品，分別配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、20、40、50、60 mg/mL和80 mg/mL的梯度樣品溶液各3 mL；精確稱量適量的MTT，在黑暗處(避光)制得濃度為1 mg/mL的黃色溶液。如不澄清則過濾備用。

1.2.3.2 細(xì)胞增殖檢測 將培育后的小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)，稀釋至1×105個/mL并接種于96孔板?？瞻卓字患覦MEM培養(yǎng)液，樣品孔分別將入各濃度的長白山紅景天多糖溶液，每孔200 μL。培養(yǎng)箱中孵育2.5 h后吸棄各孔培養(yǎng)液，各孔加入100 μL MTT溶液。培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸棄MTT溶液，各孔加入100 μL DMSO，輕輕振蕩，利用酶標(biāo)儀在570 nm處測定各孔的吸光度值。

1.2.3.3 TNF-α、IL-1β含量的測定 將培養(yǎng)至對數(shù)期的小鼠巨噬細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，稀釋至1×105個/mL并接種于6孔板中?？瞻卓字患覦MEM培養(yǎng)液，樣品孔分別加入10、20 mg/mL和50 mg/mL長白山紅景天多糖溶液，每孔2 mL。培養(yǎng)箱中孵育48 h后吸取各孔培養(yǎng)液，按照Mouse TNF-α ELISA Kit和Mouse IL-1β ELISA Kit說明書操作方法用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 長白山紅景天多糖濃度的測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 使用苯酚硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用移液管量取1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL轉(zhuǎn)于玻璃試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，每個濃度重復(fù)3次。分別向每只試管中加入6% 苯酚試劑0.5 mL，濃硫酸2.5 mL。迅速震蕩均勻冷卻至室溫，在490 nm測定吸光度A[10]。葡萄糖溶液濃度越大吸光度越大且呈線性增長，以吸收度A為縱坐標(biāo)，糖含量C為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.249 0x-0.174 8(R2=0.993 3)，見圖1。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose solution

2.1.2 樣品溶液的測定 取濃度為1.0 g/L的樣品溶液1 mL，加入苯酚試劑0.5 mL、濃硫酸2.5 mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法操作，測定吸收度A=0.262，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品吸光值計(jì)算含量，得長白山紅景天多糖純度為0.35 mg/mL。

2.2 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用考馬斯亮藍(lán)法測定長白山紅景天多糖中所含有的蛋白質(zhì)含量。稱取考馬斯亮藍(lán)10 mg。溶解于5 mL的95%乙醇中，加入10 mL的85%磷酸，用蒸餾水稀釋至100 mL，濾紙過濾備用。最終試劑中含0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250(w/v)，4.7%乙醇(w/v)。稱取牛血清白蛋白5 mg，加入1 mL蒸餾水使其成為5 mg/mL儲備液，用時加水稀釋至50 μg/mL備用。

分別量取50 μg/mL 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0. 2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL轉(zhuǎn)入玻璃試管中加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL,每個濃度重復(fù)3次，分別向每支試管中加入考馬斯亮藍(lán)試劑4 mL,迅速振蕩均勻，靜置5 min后在595 nm處測定吸光度A[13]。以吸收度A為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.206 0x+1.304 0(R2=0.995 8)，見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein solution

2.3 長白山紅景天多糖的純化 采用Sevage法除去長白山紅景天粗多糖中的蛋白質(zhì)，需要考察Sevage試劑體積比、料液比、離心時間與離心次數(shù)的四因素三水平條件對去除蛋白的影響[12-13]。為使考察條件均勻分散，整齊可比且高效節(jié)約時間，設(shè)計(jì)L9(3)4正交試驗(yàn)如表1。其中四因素三水平分別為：A為氯仿∶正丁醇(體積比)；B為樣品：Sevage試劑(體積比)；C為離心時間(min)；D為離心次數(shù)(次)，見表2。

表1 L9(3)4正交試驗(yàn)Table 1 L9 (3) 4 orthogonal test

表2 四因素三水平Table 2 Four factors and three levels

2.3.1 長白山紅景天多糖純化后含量測定 采用苯酚硫酸法測定純化后長白山紅景天多糖的含量，考馬斯亮藍(lán)法測定純化后蛋白質(zhì)的含量，根據(jù)長白山紅景天多糖含量的增加與蛋白質(zhì)含量的減少來篩選純化的最優(yōu)方案。通過測得吸光度，計(jì)算得蛋白質(zhì)保留率、多糖保留率，結(jié)果見表3。

表3 純化后測得吸光度與計(jì)算結(jié)果Table 3 Measured absorbance and calculated results after purification

比較數(shù)據(jù)可以看出第4組數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)含量顯著減少，長白山紅景天多糖含量明顯增加，為篩選得到的最優(yōu)項(xiàng)，在后面的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)中均使用以Sevage試劑5∶1、料液比3∶1、離心15 min、5次而得的長白山紅景天多糖溶液。使用Sevage法純化長白山紅景天多糖后蛋白質(zhì)大量減少，多糖含量增多，達(dá)到了目標(biāo)效果，避免了蛋白質(zhì)對細(xì)胞的影響，為免疫調(diào)節(jié)作用的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.4 紅景天多糖對細(xì)胞增殖的影響 本試驗(yàn)采用MTT法檢測不同濃度紅景天多糖對巨噬細(xì)胞增殖的影響[14]。使用酶聯(lián)儀測得570 nm處吸光度值，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，0.4～0.8 mg/mL紅景天多糖純化物可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖(P<0.05)，而高濃度紅景天多糖純化物(1.0～10.0 mg/mL)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)。提示在一定范圍內(nèi)，多糖溶液的濃度越高，對巨噬細(xì)胞的增殖作用越明顯。

圖3 紅景天多糖對巨噬細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of polysaccharides on the proliferation of macrophages與對照組相比，*:P<0.05,**:P<0.01； 下同Compared with the control group, *:P<0.05, **:P<0.01.The same as below

2.5 紅景天多糖對巨噬細(xì)胞分泌功能的影響 按照酶聯(lián)免疫試劑盒的操作方法測定紅景天多糖對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β的影響。繪制TNF-α和IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.001 8x+0.035 3 (R2=0.994 4)和y=0.012 8x+0.001 8 (R2=0.992 3)，將樣品溶液的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出的樣品中TNF-α和IL-1β濃度，結(jié)果見圖4。與對照組相比，當(dāng)長白山紅景天多糖的濃度為10 mg/mL時可促進(jìn)TNF-α的分泌(P<0.05)，當(dāng)長白山紅景天多糖的濃度為20 mg/mL和50 mg/mL時可顯著促進(jìn)TNF-α的分泌(P<0.01)。長白山紅景天多糖對巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的影響更為明顯，當(dāng)其濃度在10～50mg/mL范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)IL-1β的分泌(P<0.01)。表明長白山紅景天多糖組分可促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β因子，且細(xì)胞因子的分泌量與多糖濃度成正相關(guān)，而2種細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用。

圖4 紅景天多糖對巨噬細(xì)胞TNF-α和IL-1β分泌水平的影響Fig.4 Effect of polysaccharides on the secretion of TNF-α and IL-1β in macrophages

3 討論

多糖組分作為長白山紅景天的主要藥效組分之一，其分離純化過程成為研究重點(diǎn)。常見的提取方法包括水提取法、微波輔助法、超聲提取法。其中水提取法的優(yōu)點(diǎn)在于所需儀器設(shè)備簡單，提取過程不會破壞多糖組分的結(jié)構(gòu)和生理活性，而缺點(diǎn)在于耗費(fèi)時間較長，所得多糖組分的純度不高[15]。微波輔助法的優(yōu)點(diǎn)在于耗時短，所得多糖組分的純度較高，但受到儀器設(shè)備的限制，不易大規(guī)模提取[16]。超聲提取法利用機(jī)械、熱力等原理對多糖組分提取時不破壞其生理活性，同時具有耗時短、提取率高的優(yōu)點(diǎn)，但同樣因設(shè)備的限制，不適合大規(guī)模提取[17-18]。本試驗(yàn)為后續(xù)進(jìn)一步開發(fā)和利用長白山紅景天多糖組分，因此選擇更適合大規(guī)模提取的方式——水提取法，而為了提高多糖組分的純度，選擇利用Sevage法脫除蛋白質(zhì)，從而得到純度較高的多糖類組分[19-21]。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察了Sevage試劑體積比、料液比、離心時間、離心次數(shù)等因素，得到最終純化工藝為氯仿∶正丁醇為5∶1，樣品溶液∶Sevage試劑為3∶1，離心時間為15 min，離心次數(shù)為5次，利用本法純化后多糖組分的純度達(dá)到68%，為后續(xù)研究奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)結(jié)果對探究長白山紅景天多糖組分的藥理活性提供了新的思路，也為其進(jìn)一步應(yīng)用于抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等方面提供了物質(zhì)支持，具有一定的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。不足之處在于藥理活性的研究方面只進(jìn)行了體外免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)，還需利用動物試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。