劉佳宇 ， 溫慧之 ， 范闊海 ， 尹 偉 ， 孫耀貴 ， 孫盼盼 ， 李宏全

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 山西 太谷 030801 ； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物管理中心 ， 山西 太谷 030801)

CD40L是腫瘤壞死因子受體超家族(Tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)[1]的成員。在體內(nèi)，CD40L和CD40構(gòu)成共刺激分子,為抗原呈遞細胞、B細胞及T細胞的活化提供第2信號，啟動細胞免疫和體液免疫，是特異性免疫應(yīng)答激活的重要條件[2-3]。研究表明，將CD40L基因與抗原基因串聯(lián)構(gòu)建共表達載體，制備DNA疫苗或表達為融合蛋白接種到宿主體內(nèi)，能夠增強抗原的免疫原性[4-5]。另外，重組CD40L與疫苗聯(lián)合使用也能增強疫苗的免疫效果[6-7]。鑒于此，本試驗構(gòu)建畢赤酵母(Pichiapastoris)表達體系，體外表達重組雞CD40L，將重組雞CD40L與新城疫LaSota疫苗聯(lián)合免疫7日齡SPF雞，評價重組雞CD40L與雞新城疫LaSota疫苗聯(lián)合免疫的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、菌株及質(zhì)粒 7日齡SPF雞，購自北京生泰爾生物科技有限公司。畢赤酵母(Pichiapastoris)X-33菌株和穿梭質(zhì)粒pwPICZalpha由本實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 Ni SepharoseTM6 Fast Flow，購自美國GE公司；陽離子交換樹脂(Poros 50 HS)，購自美國Applied Biosystems公司；新城疫LaSota滅活疫苗和4% 605佐劑，均購自北京生泰爾生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒和丙二醇(MDA)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。基因?qū)雰x(SCIENTZ-2C型，寧波新芝生物科技有限公司)；層析柱(XK-16型，美國GE公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組雞CD40L的表達純化 根據(jù)NCBI登錄的雞CD40L基因序列(Gene ID:395485)和畢赤酵母(Pichiapastoris)的密碼子偏好性，將雞CD40L基因進行優(yōu)化后合成。合成的雞CD40L基因序列與穿梭質(zhì)粒pwPICZalpha連接，利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入畢赤酵母X33。通過Zeocin抗性篩選陽性菌株，將篩選到的陽性菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后收集上清，Ni-NTA Resin柱和強陽離子層析柱(HE)對表達產(chǎn)物進行純化，BCA法測定重組雞CD40L蛋白濃度。

1.3.2 分組與處理 將40羽7日齡SPF雞隨機分為3個試驗組和空白對照組(空白組)，每組10羽。第1組：1.0 μg/羽CD40L+LaSota滅活疫苗+605佐劑；第2組：0.1 μg/羽CD40L+LaSota滅活疫苗+605佐劑；第3組：LaSota滅活疫苗+605佐劑；空白對照組不做處理。試驗組頸部皮下注射疫苗。

1.3.3 樣品采集和指標的測定 免疫后14、21、28 d和35 d，采集翅下靜脈血，分離血清，通過血凝血抑試驗(HA-HI)檢測雞新城疫抗體效價，使用試劑盒檢測血清中總超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和血清丙二醛(MDA)含量，具體步驟按照說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，結(jié)果均用平均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示。

2 結(jié)果

2.1 重組雞CD40L的表達和純化結(jié)果鑒定 畢赤酵母表達上清經(jīng)Ni-NTA Resin柱和HE純化后，獲得了純度為90%的重組雞CD40L，濃度為0.315 mg/mL。

2.2 新城疫抗體效價檢測 免疫后14、21、28 d和35 d，3個試驗組的抗體效價均顯著高于空白組(P<0.05)，試驗組之間無顯著差異(P>0.05)(圖1)。結(jié)果表明，在本試驗所用劑量下，重組雞CD40L不能增加新城疫LaSota疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平。

圖1 不同時間點CD40L對各組抗體效價的影響Fig.1 Effect of CD40L at different time points on the antibody titer of each groupA：免疫后14 d抗體效價； B：免疫后21 d抗體效價； C：免疫后28 d抗體效價； D：免疫后35 d抗體效價不同字母表示差異顯著(P<0.05);下同A:Antibody titer after 14 d of immunization; B:Antibody titer after 21 d of immunization; C:Antibody titer after 28 d of immunization; D:Antibody titer after 35 d of immunizationDifferent letters indicate significant differences (P < 0.05). The same as below

2.3 血清SOD測定 免疫后14 d(圖2A)，各組血清SOD活力組間差異不顯著(P>0.05)。免疫后21 d(圖2B)，第3組SOD的活力顯著高于空白組(P<0.05)，第1組、第2組和空白組的SOD活力差異均不顯著(P>0.05)。免疫后28 d和35 d，所有組之間SOD活力差異均不顯著(P>0.05)(圖2C、2D)。結(jié)果表明，在本試驗所用劑量下，重組雞CD40L提高了雞機體內(nèi)SOD活力。

圖2 不同時間點CD40L對血清SOD活力的影響Fig.2 Effect of CD40L on serum SOD activity at different time pointsA：免疫后14 d SOD活力變化； B：免疫后21 d SOD活力變化； C：免疫后28 d SOD活力變化；D：免疫后35 d SOD活力變化A:Changes of SOD activity after 14 d of immunization; B:Changes of SOD activity after 21 d of immunization;C:Changes of SOD activity after 28 d of immunization; D:Changes of SOD activity after 35 d of immunization

2.4 血清GSH-Px測定 免疫后14 d(圖3A)，第3組和第1組GSH-Px活力均顯著高于第2組和空白組(P<0.05)，第3組顯著高于第1組(P<0.05)，第2組和空白組差異不顯著(P>0.05)。免疫后21 d和28 d(圖3B、3C)，第1組與第3組差異不顯著(P>0.05)，第2組和空白組差異不顯著(P>0.05)，第1組和第3組GSH-Px活力均顯著高于第2組和空白組(P<0.05)。在免疫后35 d(圖3D)，第1組和空白組GSH-Px活力均顯著高于第2組和第3組(P<0.05)，第1組和空白組差異不顯著(P>0.05)，第2組和第3組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，在1.0 μg/羽使用劑量下，重組雞CD40L能夠提高雞機體內(nèi)的GSH-Px活力。

圖3 不同時間點CD40L對血清GSH-Px含量的影響Fig.3 Effect of CD40L on serum GSH-Px content at different time pointsA：免疫后14 d GSH-Px活力變化； B：免疫后21 d GSH-Px活力變化； C：免疫后28 d GSH-Px活力變化；D：免疫后35 d GSH-Px活力變化A:Changes of GSH-Px activity after 14 d of immunization; B:Changes of GSH-Px activity after 21 d of immunization;C:Changes of GSH-Px activity after 28 d of immunization; D:Changes of GSH-Px activity after 35 d of immunization

2.5 血清MDA測定 免疫后14 d(圖4A)，第1組MDA含量顯著高于第2組和第3組(P<0.05)，空白組MDA含量顯著高于第2組(P<0.05)，第1組和空白組差異不顯著(P>0.05)，第2組和第3組差異不顯著(P>0.05)。免疫后21 d(圖4B)，試驗組和空白組間差異不顯著(P>0.05)。免疫后28 d和35 d(圖4C、4D)，在第1組與空白組具有顯著性差異(P<0.05)，其余試驗組間差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，在1.0 μg/羽使用劑量下，重組雞CD40L能夠降低雞機體內(nèi)MDA含量。

圖4 不同時間點CD40L對血清MDA含量的影響Fig.4 Effect of CD40L on serum MDA content at different time pointsA：免疫后14 d MDA含量變化； B：免疫后21 d MDA含量變化； C：免疫后28 d MDA含量變化； D：免疫后35 d MDA含量變化A:Changes of MDA content after 14 d of immunization; B:Changes of MDA content after 21 d of immunization;C:Changes of MDA content after 28 d of immunization; D:Changes of MDA content after 35 d of immunization

3 討論

研究表明，CD40L與疫苗有協(xié)同作用，可以增強疫苗的免疫效果。潘悅[8]將重組CD40L作為免疫增效劑與河豚毒素人工抗原一起接種小鼠，發(fā)現(xiàn)使用10 μg/只 CD40L具有顯著免疫增強效果。本試驗運用畢赤酵母表達系統(tǒng)，在體外表達獲得重組雞CD40L。將1 μg/羽和0.1 μg/羽的重組雞CD40L分別與新城疫LaSota疫苗聯(lián)合免疫后，重組雞CD40L對疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的作用無明顯增強作用。

自由基是細胞代謝產(chǎn)物，通常由活性氧和活性氮組成[9]，自由基與抗氧化分子之間存在氧化還原平衡，當(dāng)平衡受到干擾就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷細胞和組織[10-11]。自由基與機體的健康狀況息息相關(guān)[12-14]，在體內(nèi)許多生理過程中起重要的作用，包括免疫調(diào)節(jié)、細胞因子調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)和凋亡[15-16]。自由基的強弱顯著影響著機體免疫力的強弱。Kitas等[17]將鼠的B細胞與單核細胞或H2O2共孵育，發(fā)現(xiàn)無論H2O2還是單核細胞產(chǎn)生的自由基，對于B細胞的克隆形成、克隆反應(yīng)性都有抑制作用。郭亞嬌[18]的研究表明，當(dāng)哮喘模型小鼠體內(nèi)自由基減少，小鼠體內(nèi)的炎癥會得到緩解，并且機體免疫力也會提高。潘朝旺等[19]的研究表明，氧自由基過多會導(dǎo)致患關(guān)節(jié)炎大鼠免疫功能紊亂，加劇局部炎癥反應(yīng)。SOD和GSH-Px屬于抗氧化物酶，在體內(nèi)具有清除自由基的作用，構(gòu)成機體的抗氧化防御系統(tǒng)[20]，而MDA含量代表膜脂過氧化程度，間接反映組織細胞中自由基水平。本試驗中，1.0 μg/羽的重組雞CD40L與新城疫LaSota疫苗聯(lián)合免疫后，重組雞CD40L雖然不能提高雞機體內(nèi)的SOD活性，但能夠提高雞機體內(nèi)的GSH-Px活性，并降低雞機體內(nèi)的MDA含量。

綜上所述，本試驗通過畢赤酵母表達系統(tǒng)成功獲得了重組雞CD40L，在所設(shè)劑量(1.0 μg/羽和0.1 μg/羽)下，重組雞CD40L對疫苗無明顯的免疫增效作用，但能夠增強雞機體的抗氧化能力。