馬天文 ， 宋霄鵬 ， 胡海龍 ， 趙明超 ， 陳 鴻 ， 湯繼浪 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院 黑龍江省動物疾病致病機制與比較醫(yī)學重點實驗室 ， 黑龍江 哈爾濱 150036)

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種關節(jié)退化性疾病，關節(jié)軟骨退化是OA病變的主要特征，其中軟骨下骨、滑膜、關節(jié)囊、關節(jié)周圍肌肉、韌帶和半月板的損傷也可加速OA發(fā)病進程。該病嚴重影響動物健康和使疫，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。獸醫(yī)臨床中，X線檢查仍是常規(guī)診斷OA的方法。當X線片顯示關節(jié)間隙變化、骨贅增生和軟骨下骨變形等典型OA特征時已經(jīng)達到OA中晚期階段[2]。

近年來，篩選OA生物標志物成為獸醫(yī)外科研究的熱點之一[3]。特異性標志物可以應用于OA疾病的鑒定、早期診斷、預防或治療性藥物干預過程中的監(jiān)測。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)是軟骨的非膠原成分[4]，COMP促進II型膠原纖維和穩(wěn)定纖維網(wǎng)絡的結合。硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate，CS)是軟骨細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)中蛋白多糖的主要成分[5]。CS846是一種CS合成標記物，其是CS的一個新表位，也是關節(jié)軟骨中蛋白多糖的降解產(chǎn)物之一。血清中CS846和COMP濃度變化可以反映軟骨ECM降解情況，可以在出現(xiàn)關節(jié)形態(tài)改變以前就在生化代謝方面表現(xiàn)異常。為了綜合評價血清中CS846和COMP標志物在大鼠OA模型中的變化，本試驗通過切斷前十字韌帶(Anterior cruciate ligament transection，ACLT)建立大鼠OA模型，對血清中COMP和CS846的濃度進行長達10周的檢測，并評估COMP和CS846濃度變化與軟骨損傷的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 大鼠軟骨COMP和CS846 ELISA試劑盒，均購自廈門慧嘉生物科技有限公司；異氟烷，購自北京友誠盛達生物科技有限公司。切片機，購自浙江金華科迪儀器設備有限公司；光學顯微鏡，購自蘇州歐米特光電科技有限公司；外科顯微鏡，購自成都科奧達光電技術有限公司；Epoch酶標儀，購自美國BioTek公司；手術縫線，購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司。

1.2 實驗動物 從哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心購入60只雄性SD大鼠(300～350 g)。動物試驗獲得東北農(nóng)業(yè)大學實驗動物倫理委員會批準。

1.3 分組和造模 大鼠適應環(huán)境1周后進行試驗，將60只大鼠隨機分為2組，分別為對照組和模型組，每組30只。首先將大鼠放置專用誘導麻醉箱內(nèi)誘導麻醉后，異氟烷吸入維持麻醉，剃毛消毒后，大鼠右膝內(nèi)側(cè)切開2～3 cm切口，打開關節(jié)囊，將髕骨移位后在外科顯微鏡下切斷前十字韌帶，進行Lachman試驗和抽屜試驗確保前十字韌帶完全切斷后，可吸收縫線縫合傷口。模型組進行假手術，手術打開關節(jié)囊，不切斷任何韌帶。

1.4 樣品采集及處理 在造模后第0、2、4、6、8周和第10周(每組5只)收集各組大鼠右膝關節(jié)和血液。采集各組血液后1 000 g離心20 min，收集上清液，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。大鼠實施安樂死后，收集脛骨樣本，小心剝離脛骨并裸露出關節(jié)軟骨面，放入裝有4%多聚甲醛固定液的離心管內(nèi)保存。

1.5 病理組織學分析 大鼠脛骨在10% EDTA溶液中脫鈣3周，4%甲醛固定24 h后脫水，將脫水的骨組織放入石蠟中，包埋1 h。冷卻后制作各組大鼠脛骨軟骨組織切片，制作成5 μm的石蠟組織。將組織石蠟切片放入60 ℃烘箱內(nèi)1 h，脫蠟后進行蘇木-伊紅(H.E.)染色，脫水后滴加中性樹膠，蓋玻片封固。使用國際骨關節(jié)炎研究學會(OARSI)評分對脛骨H.E.染色進行評分[6]。

1.6 ELISA法檢測血清中COMP和CS846濃度 采用ELISA試劑盒測定不同時間點大鼠血清中COMP和CS846水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學分析 SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組比較采用單因素方差分析，使用斯皮爾森相關系數(shù)分析OARSI評分與COMP和CS846之間的相關性。結果以平均數(shù)±標準差表示，P<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。MedCalc軟件進行受試者工作特征曲線(ROC曲線)作圖，采用多元回歸統(tǒng)計學分析建立結合COMP和CS864檢測的數(shù)學模型(Logistic回歸方程)，并計算曲線下面積(AUC)值、靈敏度和特異度，AUC值<0.5認為有診斷價值。

2 結果

2.1 ACLT誘導大鼠OA軟骨病理變化 病理切片結果如圖1所示，大鼠OA造模后10周內(nèi)，關節(jié)軟骨病理損傷逐漸加重，關節(jié)面破壞程度逐漸增加。對照組中細胞排列有序(圖1A)，關節(jié)表面光滑；造模第2周，關節(jié)面略微粗糙，表層軟骨細胞變少，中層軟骨細胞出現(xiàn)聚集(圖1B，箭頭)；造模后第4周，關節(jié)面粗糙程度增加(圖1C，箭頭)，軟骨細胞肥大；造模后第6周軟骨細胞排列紊亂，表層軟骨細胞丟失嚴重，關節(jié)面出現(xiàn)裂痕(圖1D，矩形框)；造模后第8周軟骨表層損傷嚴重程度增加(圖1E，矩形框)，軟骨細胞大量簇集；造模后第10周軟骨部分丟失，軟骨面裂痕明顯(圖1F，箭頭)，軟骨細胞排列紊亂。OARSI評分結果如圖2所示，與對照組比較，各時間點模型組大鼠OARSI評分顯著升高(P<0.01)。

圖1 ACLT誘導大鼠OA軟骨病理變化(H.E染色，100×)Fig.1 ACLT induces pathological changes of rat OA cartilage (H.E. staining,100×)A：對照組； B：造模2周； C：造模4周； D：造模6周； E：造模8周； F：造模10周A:Control group; B:Modeling for 2 weeks; C:Modeling for 4 weeks; D:Modeling for 6 weeks； E:Modeling for 8 weeks; F:Modeling for 10 weeks

圖2 大鼠脛骨組織OARSI評分Fig. 2 OARSI score of rat tibia tissue與對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01；下圖同Compared with control group,*：P<0.05，**：P<0.01.The same as below

2.2 血清中COMP和CS846的ELISA檢測 如圖3所示，與對照組比較，建立模型10周內(nèi)，模型組大鼠血清中COMP(圖3A)和CS846(圖3B)濃度呈升高趨勢。在造膜后第2、4、6、8周和第10周各時間點，2個參數(shù)濃度較對照組都顯著升高(P<0.05)。

圖3 ACLT大鼠血清中COMP和CS846濃度變化Fig. 3 Changes in the concentration of COMP and CS846 in sera of ACLT ratsA：血清中COMP濃度變化； B：血清中CS846濃度變化A:Changes in the concentration of COMP in sera; B:Changes in the concentration of CS846 in sera

2.3 血清中COMP和CS846濃度與軟骨損傷程度的相關性 OARSI評分變化可反應軟骨損傷程度，如圖4所示，大鼠OA模型10周內(nèi)，血清中COMP與OARSI評分呈正相關(r=0.915，P<0.01)(圖4A)，血清中CS846與OARSI評分呈正相關(r=0.912，P<0.01)(圖4B)。

圖4 血清中COMP和CS846濃度與軟骨損傷程度的相關性Fig.4 Correlation between the concentration of COMP and CS846 in sera and the degree of cartilage damageA：COMP與軟骨損傷相關性； B：CS846與軟骨損傷相關性A:COMP was related to cartilage damage; B:CS846 was related to cartilage damage

2.4 血清中COMP和CS846標志物的ROC曲線分析 如圖5所示，單一和結合2個參數(shù)檢測對大鼠OA都有診斷意義(AUC值>0.5)。與單一檢測大鼠血清COMP或CS846相比，結合血清中2個參數(shù)檢測的AUC值、敏感度和特異度更高(P<0.05)，對于早期診斷OA的準確性更高。

圖5 大鼠血清中COMP和CS846的ROC曲線分析Fig. 5 Analysis of ROC curve of COMP and CS846 in rat sera

3 討論

OA是動物常發(fā)疾病，在犬、牛和馬匹中容易發(fā)生，獸醫(yī)師常通過臨床癥狀和X線檢查進行確診，手段較為單一。本試驗通過結合大鼠OA模型不同病變時期的血清中COMP和CS846參數(shù)變化，分析2個OA標志物與關節(jié)軟骨損傷相關性，為OA的早期診斷方法提供新思路。OA血清標志物在滑膜炎、關節(jié)積液和軟骨損傷等關節(jié)疾病中的重要性日益受到重視，已被證明有助于監(jiān)測疾病的進展和臨床治療[7]，篩選特異性OA標志物成為目前研究熱點。近幾年來，使用ACLT方法建立大鼠OA模型被廣泛應用于研究OA發(fā)病機制、標志物篩選和藥物干預等研究中。ACLT造模是導致關節(jié)不穩(wěn)而誘發(fā)OA，本試驗病理組織學結果顯示，隨OA病程加重關節(jié)軟骨病理損傷逐漸嚴重，在ACLT誘導模型的第2周就出現(xiàn)了早期OA特征，證明大鼠OA模型建立成功。

關節(jié)軟骨由透明軟骨組成，透明軟骨由豐富的ECM和軟骨細胞組成，并具有機械特性。COMP是與II型膠原蛋白網(wǎng)絡結合的組織特異性蛋白，CS846可反應ECM中蛋白多糖的丟失情況。當關節(jié)軟骨遭到破壞時，ECM中的COMP和CS846釋放到關節(jié)滑液中，隨后進入血液循環(huán)[8]。與對照組比較，OA患者的血清和關節(jié)滑液中COMP濃度均升高[9]。Huebner等[10]研究發(fā)現(xiàn)，滑液中硫酸角質(zhì)蛋白和COMP濃度顯著增加，與病理組織學嚴重程度呈正相關。Bai等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在結合血清中CTX-II和COMP指標變化是檢測早期兔OA的潛在方法。Georgiev等[12]研究發(fā)現(xiàn)，膝OA患者的血清中COMP水平升高，COMP變化與MRI評分具有相關性，表明COMP可能反映了膝關節(jié)的損傷程度。結合尿液CTX-II、血清COMP和CS846參數(shù)變化可以診斷OA，并預測關節(jié)損傷程度[13]。另有研究表明，關節(jié)液中COMP在馬OA模型中9周內(nèi)呈持續(xù)升高趨勢[14]。與健康馬匹相比，蒙古馬OA模型滑液中CS846水平顯著增加，并且隨著病情的加重而持續(xù)升高[15]。本試驗中得出，造模后第2周，模型組大鼠的血清中COMP和CS846濃度明顯高于對照組，一直持續(xù)到第10周試驗結束。病理損傷嚴重程度與血清中COMP和CS846水平呈顯著正相關，ACLT大鼠血清中COMP和CS846的水平越高，關節(jié)軟骨病變的程度越嚴重。由于單個血清OA標志物對于早期診斷中的敏感性和特異性較低，因此，通過ROC曲線分析COMP和CS846組合時的靈敏度和特異度，發(fā)現(xiàn)結合血清中COMP和CS846參數(shù)時ROC曲線的AUC值更高，比單個檢測COMP或CS846的敏感度和特異度更高。

在以前的研究中，已經(jīng)報道了多種OA標志物組合分析進行早期檢測和判斷疾病分期[16]，但仍需要進一步循證醫(yī)學驗證。本試驗通過檢測大鼠血清中CS486和COMP在OA發(fā)病不同時期的濃度變化，并進行組織病理學和ROC曲線分析，推測結合血清COMP和CS486參數(shù)分析對于評估病情和診斷OA具有潛在的價值，診斷敏感度高于單獨檢測COMP或CS846，血清中COMP和CS486濃度變化可反應ECM的降解情況，從而進一步反應關節(jié)軟骨損傷程度。