徐怡朦 唐 靚 王 晗 楊亞冬 趙思雨 張文元

1 杭州醫(yī)學院生物工程研究所，浙江省杭州市 310013； 2 杭州醫(yī)學院保健食品研究所； 3 杭州醫(yī)學院衛(wèi)生學研究所

導致肝癌預后較差的一個重要原因就是肝癌細胞易產生耐藥性[1]。當前臨床經驗采用手術以及放療和化療的方式進行治療，雖然對抑制肝癌細胞的增生起到了一定的效果，但往往同時對患者的身體產生較大的毒副作用，甚至對正常細胞產生一定的殺傷力[2]。在這種背景下，中醫(yī)或中西醫(yī)結合抗癌研究非?；钴S。中藥抗癌作用具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應的特點，同時毒副作用相對較低，能提高機體免疫力，不易產生耐藥性[3]。中醫(yī)藥治療或中西醫(yī)結合治療肝癌被越來越多的患者所接受，中醫(yī)藥治療重視全身的整體治療，對患者產生的副作用小，利于改善患者的生命質量。隨著臨床經驗的不斷豐富，中藥治療肝癌的方式逐步得到臨床的認可，在肝癌的治療中發(fā)揮了重要作用[4-5]。

白術[6-7]和薏米[8-9]作為傳統(tǒng)中藥被廣泛使用，它們的主要化學成分有揮發(fā)油、多糖、內酯類等，具有抗腫瘤、抗炎、調節(jié)消化系統(tǒng)等藥理作用。臨床常應用于胃腸道疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等治療。肝癌是我國常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高、進展快的特點。3D生物打印作為新型高通量藥篩平臺已經成為臨床前藥物篩選的新的選擇方向。3D細胞培養(yǎng)相對于2D平面培養(yǎng)，藥物反應、抗藥性程度以及藥物滲透水平等各方面更接近于體內真實情況[10]，更能準確反映人體用藥反應[11]。本研究采用3D生物打印技術構建SMMC-7721細胞 3D水凝膠類肝癌模型，并進行白術和薏米兩種中藥醇提液的藥敏試驗，為臨床上肝癌中醫(yī)治療提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細胞購自上海中科院細胞庫。白術和薏米(圖1)購自安徽省亳州市網上藥店藥掌柜，符合2015年版《中華人民共和國藥典》。低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Lot:8119261)，胰蛋白酶(Sigma-Aldrich，批號：T4049)，海藻酸鈉(Sigma-Aldrich,Lot#SLBD5697v)，明膠(Sigma-Aldrich,Lot#SLBB0914v)，無水CaCl2(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司,Lot.No.20150507)，鈣黃綠素-AM(calcein-AM，CAM，Solarbio，LotNO405A)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，Solarbio, LotN1025A)。3D生物打印機(BioScaffolder2.1，GESIM公司，德國)，CO2培養(yǎng)箱(HEPA Class100，Thermo)，熒光倒置顯微鏡(IX73，Olympus，日本)，3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，酶標儀(Thermo公司)。96孔培養(yǎng)板(Corning)，25cm2培養(yǎng)瓶(Corning)。

白術 薏米圖1 白術和薏米

1.2 中藥醇提方法 白術和薏米提取物由下述步驟提取。稱取生藥30g，用去離子水清洗1遍，加40℃的去離子水1 000ml浸泡0.5h。將其全部置于砂鍋內煎，將粗制的水煎液倒入燒杯，放于恒溫磁力攪拌器上80℃加熱濃縮藥液至50ml，靜置至室溫后封口于4℃沉淀過夜。之后收集上清液用于進一步提取。待冷卻至室溫后邊攪拌邊緩慢加入適量95%乙醇溶液，使乙醇終濃度達到80%，4℃冰箱靜置過夜。1 000g離心10min分離沉淀和上清。上清收集后上80℃加熱，使乙醇充分蒸發(fā)，最后得醇提的濃縮液5ml，生藥含量為2.4g/ml。將分離得到的上清用0.22μm濾膜抽濾除菌后置于玻璃瓶內，4℃保存。

1.3 中藥醇提液對2D肝癌細胞培養(yǎng)的增殖抑制率及細胞存活率 SMMC-7721細胞長到80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取對數生長期的SMMC-7721細胞懸液，通過臺盼蘭染色、計數，確認細胞存活率>90%。取SMMC-7721細胞懸液以1×105cells/ml濃度接種96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h；棄上清，分別加入2種中藥提取物配制的6種濃度的藥液(1.2、0.48、0.24、0.16、0.12、0.096g/ml)，200μl/孔，每個濃度設3個復孔，顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，并拍照記錄；48h后，吸棄上清，每孔加入500μg/ml MTT 100μl，37℃靜置避光培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μl二甲基亞砜；室溫振蕩10min使沉淀結晶完全溶解，酶標儀490nm波長檢測每孔的吸光度OD值。根據吸光度計算不同時間不同濃度的中藥對細胞的增殖抑制率，增殖抑制率IR(%)=(無藥物對照組OD值-藥物處理組OD值)/(無藥物對照組OD值-空白組OD值)×100%。細胞存活率CSR(%)=(1-增殖抑制率)×100%。

1.4 3D生物打印技術構建肝癌模型 SMMC-7721細胞水溶膠共混物的制備：1.5g海藻酸鈉干粉、0.5g明膠干粉加于20ml生理鹽水中，低速攪拌混勻，形成水溶膠。每天70℃、30min水浴間歇滅菌，連續(xù)3d。然后將滅菌后的水溶膠與SMMC-7721細胞懸液5∶1混合，輕柔混勻，經300g離心3min，使氣泡消失。得到細胞密度為2×107cells/ml的SMMC-7721細胞水溶膠共混物(簡稱7721細胞共混物)。

3D生物打印是基于微流連續(xù)擠出的生物繪圖技術，進行結構體的CAD建模與控制參數。擬構建內部結構為網格狀的結構體，尺寸大小為8mm×8mm×0.5mm，該網狀結構體由圓柱狀微絲逐層交錯堆積形成，微絲交錯構成的孔隙大小設定為200μm×200μm。3D生物打印成形過程的主要控制參數:成形溫度8℃，打印噴頭內徑為0.15mm，打印速率為15mm/s，擠出壓力200kPa，上升層高為0.15mm，料桶溫度37℃，與打印噴頭相連。

進行3D生物打印肝癌7721細胞結構體：將7721細胞共混物置于3D生物打印機的料桶中，按照預先設定的CAD數字模型及成形參數，由空氣氣壓推動柱塞水溶膠擠出成形。將7721細胞共混物擠出圓柱狀微絲，逐層交錯堆積于無菌6孔培養(yǎng)板中，形成三維網狀結構體。擠出的共混物因明膠的溫度敏感性發(fā)生物理交聯(lián)，由溶膠轉變?yōu)槟z。打印后立即用5%CaCl2溶液交聯(lián)5min，海藻酸鈉轉變?yōu)楹Ｔ逅徕}凝膠，使支架結構得以穩(wěn)固，低糖-DMEM培養(yǎng)基漂洗3次。獲得半透明網格狀帶氣孔的、有較高孔隙率的肝癌7721細胞—海藻酸鈉—明膠三維結構體，即肝癌模型。

1.5 中藥對3D肝癌模型中肝癌細胞增殖力的作用 將打印好的細胞結構體(肝癌模型)置于96孔板，用完全培養(yǎng)基(含10%FBS)200μl/孔培養(yǎng)，隔天換液。實驗組：肝癌模型中的肝癌細胞培養(yǎng)5d后去除廢液，PBS清洗,取不同濃度(1.2、0.48、0.24、0.16、0.12、0.096g/ml)的醇提中藥，200μl/孔培養(yǎng)，每組設3個復孔。加藥后再培養(yǎng)48h，除去廢液，PBS清洗，作為實驗組。而對照組不加藥液，于培養(yǎng)7d后除去廢液，PBS清洗。進行如下活/死細胞染色并計算細胞存活率。

活/死細胞染色：根據制造商說明書，熒光活/死染色法用于確定充滿細胞的3D結構中的細胞活力。將上述SMMC-7721細胞結構體在PBS中輕輕清洗3次，然后浸入染色液中。以PBS配置1μM calcein-AM和2μM PI染色液，對活細胞(綠色)和死細胞(紅色)進行30min的避光染色。采用熒光倒置顯微鏡分別在488nm(calcein-AM的激發(fā)波長)和543nm(PI的激發(fā)波長)處進行圖像采集，并合并這2個激發(fā)波長的圖像。每種樣品隨機抽取三個視野。細胞存活率=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism8統(tǒng)計軟件包進行分析,使用非線性回歸和方差分析，組間兩兩比較，實驗數據用mean±SD表示，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SMMC-7721細胞2D與3D形態(tài)對比觀察 生長在2D平板上的SMMC-7721細胞保持單層，呈現(xiàn)扁平形態(tài)，與平板緊密貼壁(圖2)。3D打印的7721細胞—海藻酸鈉—明膠3D結構體，為半透明網狀高孔隙度3D結構(圖3)。

圖2 光鏡下2D平面生長的SMMC-7721細胞(×100，標尺=100μm)

圖3 剛打印的3D結構體支架

倒置顯微鏡觀察新打印的3D結構體SMMC-7721細胞(0h)，細胞呈球形，表面光滑，均勻分布于水凝膠中(氣孔除外)。打印48h后，細胞仍為光滑的球形，靠近孔的細胞因營養(yǎng)豐富而迅速增殖為多細胞簇。箭頭表示細胞之間緊密相連。打印96h后，觀察到孔附近的細胞已增殖為束狀多細胞簇。箭頭表示束狀多細胞簇(圖4)。

圖4 培養(yǎng)0h、48h、96h的3D SMMC-7721細胞(×100，標尺=100μm)

2.2 2D培養(yǎng)條件下中藥對SMMC-7721細胞增殖的抑制率 為了找到SMMC-7721的最佳TCM及其最佳濃度，本實驗測試了白術、薏米醇提液對2D環(huán)境中細胞的抑制作用。在2D培養(yǎng)條件下，SMMC-7721細胞對不同中藥及其不同濃度的敏感性存在顯著差異，白術提取物對肝細胞癌有更好的效果。薏米提取物在低濃度時(0.096、0.12g/ml)，促進了SMMC-7721細胞生長。隨著提取物濃度的增加，白術和薏米提取物對肝癌細胞的抑制率增加(圖5)。

圖5 2D培養(yǎng)條件下白術和薏米提取物對SMMC-7721細胞生長的抑制率

2.3 3D培養(yǎng)條件下中藥對SMMC-7721細胞存活的影響 3D培養(yǎng)的SMMC-7721細胞分別用白術、薏米醇提液處理48h后，通過雙熒光活/死染色發(fā)現(xiàn)：當白術濃度為1.2g/ml和0.48g/ml時，沒有SMMC-7721細胞存活，死細胞邊緣不規(guī)則，部分細胞已經碎片化。在濃度為0.24g/ml和0.16g/ml時，發(fā)現(xiàn)少量活細胞，但細胞起皺。在濃度為0.12g/ml和0.096g/ml時，活細胞數量略有增加，但大量活細胞仍處于萎縮狀態(tài)(圖6)。

當薏米濃度為1.2g/ml時，SMMC-7721活細胞比例高于其他低濃度組，甚至高于空白對照組，而其他低濃度組無顯著差異。薏米高濃度會增加細胞的存活率。這與2D中發(fā)生的情況相反(圖6)。

通過圖6合成圖7。在3D培養(yǎng)條件下，白術醇提液的藥效明顯強于薏米。藥物濃度與細胞抑制率呈顯著的線性關系。薏米醇提液的作用較弱，且濃度與細胞抑制率之間沒有顯著的線性關系(圖7)。

圖6 3D培養(yǎng)條件下白術和薏米提取物對SMMC-7721細胞存活的影響(×100倍)

根據細胞存活率=(1-增殖抑制率)×100%，將圖5與圖7合并為圖8。白術提取物在2D和3D培養(yǎng)條件下都對SMMC-7721細胞具有良好的殺傷作用，兩者間差異不顯著，并且藥物濃度與細胞抑制率呈顯著線性關系。而薏米提取物對SMMC-7721細胞殺傷效果差，其濃度與細胞抑制率無明顯線性關系。使用非線性回歸得出IC50值：白術在2D條件下IC50值為0.114 7g/ml，3D條件下為0.074 2g/ml；薏米在2D條件下IC50值為0.160 8g/ml，3D條件下無IC50值；方差分析進行二種中藥的2D與3D存活率比較，P值均<0.000 1。

圖7 3D培養(yǎng)條件下SMMC-7721細胞在白術和薏米提取物作用下的存活率

在3D培養(yǎng)條件下，白術醇提液的藥效明顯強于薏米。藥物濃度與細胞抑制率呈顯著線性關系。薏米醇提液的作用較弱，且濃度與細胞抑制率之間沒有顯著的線性關系(圖8)。

圖8 白術和薏米提取物在2D和3D條件下分別對SMMC-7721細胞作用的存活率*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 ****P<0.000 1

3 討論

當前臨床經驗采用手術以及放療和化療的方式進行肝癌的治療，化療在綜合治療中占有重要的地位，雖然對抑制肝癌細胞的增生起到了一定的效果，但往往同時對患者的身體產生較大的毒副作用，人體對化療藥物的個體差異性也大，當臨床確定患者對應用的藥物不敏感時，患者已經承受了極大的痛苦及嚴重的不良反應，甚至殺傷了正常細胞[12-13]。在這種背景下，醫(yī)學專家把希望寄托在中藥抗癌研究上，尋求中醫(yī)或中西醫(yī)結合治療，中醫(yī)藥領域抗癌的研究異?；钴S。中藥可以通過誘導肝癌細胞凋亡[14]、細胞周期阻滯和遷移抑制等方式，對肝癌的治療產生明顯的作用[15]。同時，由于中藥性質比較溫和，對患者身體的損傷較小，中藥或與放化療相配合，可以提高患者生存質量、改善體質、緩解臨床癥狀、減輕放化療副作用[16-17]，可在今后臨床治療肝癌中推廣應用，中西醫(yī)結合治療已經成為重要的治療手段[18-19]。利用中藥活性成分研發(fā)新藥是我國藥物研究的特色和捷徑，尋找有效的中藥對改善肝癌患者預后具有極其重要的意義[20-21]。

腫瘤細胞的耐藥現(xiàn)象是影響化療療效和患者預后的重要因素之一[22]，導致肝癌預后較差的一個重要原因就是肝癌細胞易產生耐藥性。建立適合的體外耐藥模型是耐藥研究的關鍵。經驗性化療存在一定盲目性，而通過檢測腫瘤對化療藥物的敏感度，可合理聯(lián)合用藥，以“個體化”化療取代盲目性化療。

三維(3D)生物打印技術可將細胞與材料一起混合打印，細胞可深入基質材料內部，實現(xiàn)細胞3D定位與控制，構建更接近體內癌細胞病變的3D腫瘤模型[11,23]，促進抗癌藥物的篩選。3D培養(yǎng)組織細胞對外界,尤其是對藥物的抵抗力增強，可更準確地反映候選藥物的效果[24]。海藻酸鈉和明膠基本滿足支架3D打印材料的要求。海藻酸鈉是從天然褐藻中提取的多糖，與細胞外基質中的糖胺聚糖相似，具有良好的水溶性和生物相容性。海藻酸鈉可與鈣離子快速結合，在原位形成穩(wěn)定的凝膠[24]，細胞損傷小。其凝膠狀的網狀結構提供了足夠的附著表面，使肝癌細胞在更接近生理的環(huán)境中生長，這有助于細胞保持活性并分泌大量基質。明膠是一種對溫度敏感的天然高分子材料，具有良好的生物相容性和生物降解性[25]。

已有研究表明，白術和薏米具有廣泛的抗腫瘤藥理活性，能協(xié)同化療藥物的治療，常作為抗腫瘤中藥使用。在本實驗中，白術醇提液無論是在2D還是3D條件下對7721細胞的殺傷力效果都很好，但是在3D條件下，醇提液的藥效減弱幅度較大。2D與3D差異顯著，總體原因可能是由于水凝膠和3D細胞狀態(tài)引起的細胞表達的分子差異，以及細胞微環(huán)境的變化，導致2D培養(yǎng)細胞和3D培養(yǎng)細胞之間顯著不同的藥物作用結果。與2D和3D細胞培養(yǎng)相比，3D打印的SMMC-7721水凝膠結構的耐化學性明顯增強。結果表明，維度對化療的有效性起著重要的作用。