蘇鴻雨，黃程程，劉耀川，陳夢(mèng)涵，朱曉明，劉利鵬，張德顯，劉明春

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110866)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes，T.pyogenes)是一種條件性致病菌，可黏附于動(dòng)物的乳房、泌尿生殖道、呼吸道等部位，引起豬、牛、羊等動(dòng)物的乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等化膿性感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。由于缺乏有效的疫苗，到目前為止，T.pyogenes引起的感染主要依靠使用抗菌藥物來進(jìn)行治療。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，有關(guān)T.pyogenes耐藥性的報(bào)道越來越多，尤其是對(duì)臨床常用的大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素的耐藥問題，已引起人們的關(guān)注[4-6]。存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上的外排蛋白的外排作用，可以使藥物在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的聚集減少，從而使細(xì)菌逃避藥物的抑殺作用，該機(jī)制被普遍認(rèn)為是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要方式之一。外排基因mefA可介導(dǎo)革蘭陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性。在對(duì)大環(huán)丙酯類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌中，外排基因mefA的檢出率為20.5%[7]。而有關(guān)T.pyogenes耐藥機(jī)制的研究報(bào)道較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大環(huán)丙酯類抗生素產(chǎn)生耐藥的T.pyogenes分離株中，mefA基因的檢出率為18.2%[8]。MefA蛋白的外排作用可能是介導(dǎo)該菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一。外排泵抑制劑可以通過抑制外排基因的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)/消減耐藥菌株的耐藥性，有望成為抗耐藥菌新藥研發(fā)的主要策略[9]。

利血平是一種公認(rèn)的外排泵抑制劑，可逆轉(zhuǎn)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類、四環(huán)素類等多種抗生素的耐藥性[10-12]。但尚未見有關(guān)利血平對(duì)T.pyogenes外排蛋白外排作用影響的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)通過檢測(cè)利血平作用后T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥表型、外排基因mRNA表達(dá)水平及其編碼蛋白表達(dá)水平的變化情況，分析T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主動(dòng)外排機(jī)制，以期為深入研究T.pyogenes的耐藥機(jī)制及尋找抗耐藥菌藥物作用的新靶標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株與藥物2株攜帶mefA(17，20號(hào))基因的T.pyogenes，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；利血平標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限責(zé)任公司；乙酰螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自大連美侖生物有限責(zé)任公司；紅霉素、羅紅霉素、替米考星、阿奇霉素及泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2×Easy Taq PCR SuperMix、RNA Disslution、TransScrip ALL-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；一抗(自制兔抗T.pyogenesMefA蛋白多克隆抗體，效價(jià)為1∶64 000)；二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體)北京百奧萊博科技有限公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.2 利血平逆轉(zhuǎn)T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定紅霉素(erythromycin)、羅紅霉素(roxithromycinid)、乙酰螺旋霉素(acetylspiramycin)、泰樂菌素(tylosin)、阿奇霉素(azithromycin)和替米考星(tilmicosin)6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及外排泵抑制劑利血平對(duì)2株攜帶攜帶mefA基因的T.pyogenes的最小抑菌濃度(MIC)，每種藥物進(jìn)行3個(gè)平行，同時(shí)以ATCC 19411即T.pyogenes標(biāo)準(zhǔn)菌株為質(zhì)控菌[13]。

根據(jù)利血平對(duì)T.pyogenesMIC的測(cè)定結(jié)果，將利血平稀釋成對(duì)應(yīng)菌株的1/2,1/4,1/8,1/16 MIC作為工作濃度，測(cè)定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)亞抑菌濃度利血平作用后的各菌株的MIC值，分析利血平作用前后T.pyogenes對(duì)抗生素耐藥性的變化情況，并確定各菌株恢復(fù)對(duì)抗生素敏感性的最佳作用條件，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成選擇GenBank中收錄的T.pyogenes16S rRNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)的內(nèi)參基因(KY694370.1)。根據(jù)mefA基因序列的測(cè)序結(jié)果，分別設(shè)計(jì)mefA和16S rRNA的熒光定量PCR引物，將設(shè)計(jì)完成的引物序列提交到生工生物官方網(wǎng)站上進(jìn)行合成[14]。引物信息詳見1。

1.4 利血平作用前后T.pyogenes總RNA的提取分別取藥物作用前和1/2 MIC利血平作用36 h的T.pyogenes菌液，按照說明書采用Trizol法提取T.pyogenes的總RNA。利用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。最后利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA[15]，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 mefA和16S rRNA基因引物序列

1.5 利血平作用前后菌株的mefAmRNA表達(dá)量的檢測(cè)以利血平作用前后菌株的cDNA為模板，以熒光定量PCR的引物為特異性引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷熒光定量PCR引物的擴(kuò)增效率，當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率幾乎一致，而且都接近于100%時(shí)，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平[16]。

1.6 利血平作用前后菌株的MefA蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)分別取利血平作用前后的T.pyogenes菌液，采用溶菌酶破壁、超聲處理的方法提取其總蛋白；用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，加入Loading Buffer，98℃變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE；將蛋白濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，脫脂奶粉4℃封閉。BSA 4℃一抗過夜孵育，37℃二抗孵育1.5 h，最后曝光檢測(cè)[17]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析按文獻(xiàn)[18]的方法，基因轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)表達(dá)倍數(shù)計(jì)算結(jié)果為2-△△Ct。利用Azure Biosystems軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

使用SPSS 17.0軟件對(duì)利血平作用前后目的基因mefA的mRNA表達(dá)量及MefA蛋白表達(dá)量的差異顯著性進(jìn)行分析。使用GraphPad Prism 5.0對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 利血平逆轉(zhuǎn)T.pyogenes耐藥性的檢測(cè)結(jié)果見表2。利血平對(duì)17和20號(hào)T.pyogenes的MIC值均為32 mg/L。亞抑菌濃度利血平作用T.pyogenes后，篩選出利血平逆轉(zhuǎn)T.pyogenes耐藥性的最佳條件為1/2 MIC作用36 h。依據(jù)各藥對(duì)T.pyogenesATCC19411的MIC值，判定T.pyogenes對(duì)羅紅霉素、乙酰螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素、阿奇霉素和紅霉素的耐藥臨界點(diǎn)分別為2,1,8,2,4,1 mg/L。據(jù)此判斷，利血平作用后的17號(hào)和20號(hào)菌株對(duì)替米考星和阿奇霉素均由耐藥轉(zhuǎn)為敏感。利血平作用后6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)攜帶mefA基因的17號(hào)T.pyogenes的MIC值下降到利血平作用前的 1/4～1/32，而20號(hào)菌株的MIC值下降到利血平作用前的1/2～1/8。

表2 1/2 MIC利血平作用前后T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的MIC值 mg/L

2.2 利血平作用后T.pyogenes外排基因mefAmRNA表達(dá)水平的變化利血平作用后T.pyogenes外排基因mefAmRNA相對(duì)表達(dá)量變化情況如圖1所示。設(shè)利血平處理前T.pyogenesmefA基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為1，1/2 MIC利血平作用耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物分離株36 h后， 2株分離株mefA基因mRNA表達(dá)水平(利血平作用前是作用后的5.18，17.54倍)均極顯著降低(P<0.01)，而溶劑對(duì)T.pyogenesmefA基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平無顯著性影響。

2.3 利血平作用后T.pyogenes外排蛋白MefA表達(dá)水平的變化采用Western blot技術(shù)檢測(cè)外排蛋白MefA的表達(dá)量，設(shè)利血平作用前T.pyogenes的MefA表達(dá)量為1，利血平作用前后T.pyogenesMefA的表達(dá)量及其變化情況如圖2，3所示。1/2 MIC利血平作用耐藥菌株36 h后，外排蛋白MefA較藥物作用前也分別顯著降低(利血平作用前是作用后的1.08，1.70倍)。

圖1 利血平作用前后T.pyogenes mefA mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(**P<0.01，下同)

1,2.利血平作用前17,20號(hào)T.pyogenes分離株；3,4.利血平作用后17,20號(hào)T.pyogenes分離株

圖3 利血平對(duì)T.pyogenes外排蛋白MefA表達(dá)量的影響

3 討論

T.pyogenes可引起牛、羊、豬等多種經(jīng)濟(jì)類動(dòng)物的化膿性感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前臨床上治療T.pyogenes感染性疾病的藥物主要有大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類和四環(huán)素類等抗生素[19]。但是由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在畜牧行業(yè)的應(yīng)用極其廣泛，導(dǎo)致T.pyogenes對(duì)該類抗生素產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，因此開展與耐藥機(jī)制相關(guān)的研究、研發(fā)新藥已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[20]。據(jù)報(bào)道，介導(dǎo)T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的外排基因有msr和mef等，由它們編碼的膜蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入菌體內(nèi)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物外排，從而使抗生素的藥效降低甚至失效[21]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物的T.pyogenes分離株中外排基因mefA的檢出率為18.2%，且攜帶mefA基因的菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素存在多重藥耐現(xiàn)象[22]。

外排泵抑制劑是一類具有抑制細(xì)菌外排泵作用的物質(zhì)，可通過抑制外排基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯來逆轉(zhuǎn)或消減細(xì)菌的耐藥性。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，外排泵抑制劑氫氯苯腙(CCCP)可以抑制鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)外排基因adeB的表達(dá)；奧美拉唑(omeprazole)可以抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)NorA的表達(dá)量[22-23]。與耐藥相關(guān)的外排泵Bmr的氨基酸序列中纈氨酸和苯丙氨酸能夠與公認(rèn)的外排泵抑制劑利血平結(jié)合，從而抑制枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)向外泵出藥物；還可以抑制金黃色葡萄球菌耐藥泵NorA的活性，提高耐諾氟沙星菌株對(duì)其的敏感性[24-26]。

到目前為止，有關(guān)外排泵抑制劑利血平對(duì)細(xì)菌耐藥基因及耐藥蛋白的影響鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)主要從利血平作用前后2株攜帶mefA基因的T.pyogenes的耐藥性變化情況、外排基因及其編碼蛋白表達(dá)水平的變化情況，探究利血平對(duì)T.pyogenes外排基因mefA的影響。研究發(fā)現(xiàn)，1/2MIC 利血平作用菌體 36 h 后，T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性明顯降低，甚至逆轉(zhuǎn)了菌株對(duì)替米考星和阿奇霉素的耐藥性；利血平亦顯著抑制了外排基因mefA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及其編碼蛋白MefA的表達(dá)水平。提示利血平可能是通過影響外排蛋白MefA的表達(dá)減少菌體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的外排作用，從而消減了T.pyogenes對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性。但由于攜帶mefA基因的菌株數(shù)量較少，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。